摘要：为了检测靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的FnCas9-rgRNA敲除载体是否构建成功,试验先构建FnCas9-rgRNA敲除载体骨架并对其进行测序,然后将黄色荧光蛋白(EYFP)、PRRSV分别与各自的FnCas9-rgRNA敲除载体转染至HEK293、Marc145细胞内,通过流式细胞仪分析HEK293细胞内的荧光强弱及Marc145细胞的病变程度,并对FnCas9-rgRNA敲除载体的初步构建、载体活性进行研究。结果表明:FnCas9-rgRNA敲除载体骨架测序正确,流式细胞仪分析显示FnCas9-rgRNA敲除载体对HEK293细胞内EYFP基因的表达产生明显抑制作用,表达荧光的细胞数量明显下降,3种针对PRRSV设计的rgRNA分别与FnCas9表达载体共转染细胞,接种病毒后Marc145细胞病变程度明显降低。说明靶向PRRSV的FnCas9-rgRNA敲除载体构建方式正确且FnCas9-rgRNA敲除载体具有活性。

摘要：优选玉屏风多糖脂质体的最佳工艺并对其进行表征验证。采用逆向蒸发法制备玉屏风多糖脂质体,以膜材比、脂药比和超声时间为考察因素,包封率为评价指标,采用L9(34)正交试验设计优选制备条件,以超速离心法测定包封率,体外释药试验验证,纳米颗粒分析仪和透射电镜测定其粒径大小与形态。制备玉屏风多糖脂质体的最佳工艺为膜材比8∶1,脂药比4∶1,超声时间90s,包封率88.38%,24h累积释放率73.45%,平均粒径132.65nm。制备的玉屏风多糖脂质体具有较高的包封率与良好的缓释作用,粒径和形态较均匀,重现性好。

摘要：为了优选黄芪多糖脂质体的最佳工艺并对其进行表征验证,采用逆向蒸发法制备黄芪多糖脂质体,以膜材比、脂药比和超声时间为考察因素,包封率为评价指标,采用L9(3^4)正交试验设计优选制备条件,以超速离心法测定包封率,纳米颗粒分析仪和透射电镜测定其粒径大小与形态。结果显示,制备黄芪多糖脂质体的最佳工艺为膜材比8∶1,脂药比4∶1,超声时间90 s,包封率93.77%,24 h累积释放率62.67%,平均粒径557 nm。表明制备的黄芪多糖脂质体具有较高的包封率与良好的缓释作用,粒径和形态较均匀,重现性好。

摘要：为了快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV),试验针对NDRV保守序列设计特异性引物,将RT-LAMP技术与荧光染料钙黄绿素结合,建立NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP快速检测方法,并对该方法的反应温度、时间及体系进行优化,检测该方法的特异性和敏感性,同时采集12份临床疑似NDRV感染的病料分别用钙黄绿素可视化RT-LAMP方法和常规RT-PCR方法进行检测,比较两者的阳性检出率。结果表明:成功构建NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP快速检测方法;优化后的反应温度为66℃,反应时间为50 min,反应体系中Mg^(2+)浓度为3.0 mmol/L,甜菜碱浓度为0.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.3 mmol/L,Bst DNA聚合酶的浓度为0.32 U/μL,AMV反转录酶的浓度为0.14 U/μL,内外引物浓度比为10∶1,环外引物浓度比为4∶1。该方法可特异性检测出NDRV;对NDRV的最低检测量约为200 fg;用该方法对临床疑似NDRV感染的病料进行检测,阳性率为91.67%,而常规RT-PCR方法阳性率为83.33%,并且钙黄绿素可视化RT-LAMP方法能通过颜色变化观察反应结果。说明试验建立的RT-LAMP检测方法特异性好,敏感性强,读取结果更方便直观。

摘要：本研究从广州番禺某鸡场送检病死鸡中分离获得1株疑似Ⅰ群禽腺病毒。病鸡剖检以心包积液、肝脏呈土黄色并伴有出血点,肾脏肿胀、出血为主要特征。实验室通过血凝试验、PCR鉴定、序列测定及遗传进化分析、动物回归试验、病理组织学观察等进行一系列检测。结果显示,该毒株不能凝集鸡红细胞,根据FAdV的六邻体(Hexon)基因设计引物,进行PCR扩增和单克隆测序,PCR扩增出分子量约为550bp的特异性条带,通过序列测定和遗传进化分析表明,该分离病毒株与FAdV-4的相似性最高。同时用该分离毒株的鸡胚尿囊液感染28日龄雏鸡,试验鸡可复制出与临床相似病例,病理组织学观察可见,心肌细胞有炎性细胞浸润,肝内有嗜碱性包涵体等病变特征。综上,分离株B13为Ⅰ群FAdV-4。

摘要：本研究旨在克隆、表达鸭干扰素刺激基因(interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 5,IFIT5)并制备其多克隆抗体。根据GenBank公布的绿头鸭IFIT5(登录号:KF956064)序列设计特异性引物,PCR扩增获得鸭IFIT5基因,并构建原核表达重组质粒pET-30a-IFIT5和pET-32a-IFIT5及真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5。原核表达获得鸭IFIT5重组蛋白后,进行SDS-PAGE分析,并利用镍柱亲和层析方法对重组蛋白进行纯化。以纯化的鸭IFIT5重组蛋白为免疫原制备兔抗鸭IFIT5多克隆抗体。利用间接ELISA测定多克隆抗体效价、用Western blotting鉴定其特异性;将真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5转化BHK21细胞,通过间接免疫荧光法鉴定多克隆抗体的反应性。结果表明:目的蛋白主要以包涵体的形式存在;制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体效价达1∶49600,可特异性识别鸭IFIT5重组蛋白,间接免疫荧光试验则表明纯化的多克隆抗体可特异性识别BHK21瞬时真核表达的鸭IFIT5蛋白。综上,成功克隆了鸭干扰素刺激基因IFIT5,制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体可用于鸭IFIT5蛋白的检测,可为鸭IFIT5蛋白的后续研究提供材料支撑。