摘要：背景:骨科学界正致力于磷酸钙骨水泥的改性研究,通过向磷酸钙骨水泥中加入不同的添加剂,包括固化促进剂、增塑剂、抗水/血溶剂、致孔剂、增强剂,或是将生物活性物质或药物复合到磷酸钙骨水泥中,以提高其理化和生物学性能是目前该领域的研究热点。目的:了解一种新型可注射可降解的磷酸钙骨水泥的理化性能。设计、时间及地点:重复测量试验,于2008-12/2009-05在华南理工大学材料学院国家重点实验室完成。材料:采用部分结晶的磷酸钙,部分结晶的磷酸锶和二水磷酸氢钙,添加改性淀粉﹑Ⅰ型胶原制备了新型可注射自固化磷酸钙骨水泥。方法:采用X’PertPro型X射线衍射仪对磷酸钙骨水泥固化体进行相分析。采用HITA2-CHIH-800型透射/扫描电子显微镜对磷酸钙骨水泥固化体的形貌进行观察。用维卡仪根据美国材料与试验协会ASTMC190203标准进行凝结时间的测试。使用Instron5567型万能电子材料试验机来测试固化样品的抗压强度。用注射器测试材料的可注射性,针头内径为1.6mm。通过浸泡摇动定性测试材料的抗溃散性。主要观察指标:①骨水泥水化产物的相组成和显微结构。②骨水泥的凝固时间、可注射性和抗压强度。③骨水泥的抗溃散性。结果:研究表明该材料具备优良的可注射性能;添加改性淀粉显著的改善了骨水泥的抗溃散性。随着骨水泥液固比的增大,骨水泥的抗压强度下降,当骨水泥的液固比为0.3时,骨水泥的抗压强度为(48.0±2.3)MPa,当骨水泥的液固比为0.6时,骨水泥的抗压强度下降为(21.0±2.5)MPa。骨水泥的水化产物为类骨羟基磷灰石结晶,从X射线衍射图谱还可以看出,因骨水泥的水化不完全,基线水平波动较大,说明了在充分水化的条件下,骨水泥的压缩强度还能进一步提高。结论:制备的可注射含锶复合胶原磷酸钙骨水泥符合人体生物力学强度,能满足手术条件要求。

摘要：目的 从耐亚胺培南革兰阴性杆菌中筛查金属β内酰胺酶（MBL）及1型新德里金属蛋白酶（NDM）-1,为NDM-1携带菌感染的治疗及防控提供试验依据.方法 回顾性对广州市妇女儿童医疗中心2010年从7例患者分离的7株耐亚胺培南革兰阴性杆菌进行NDM-1基因筛查,使用亚胺培南-EDTA双协同试验筛查MBL阳性菌株,设计特异性引物PCR扩增NDM-1基因,并将其克隆入pMD-T载体,转化Dh5a,提取重组质粒进行EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定,并将重组质粒菌进行测序验证.结果 从7株亚胺培南耐药革兰阴性杆菌中筛出2株MBL阳性株,分别为1株鲍曼不动杆菌和1株琼氏不动杆菌,其中MBL阳性琼氏不动杆菌PCR扩增出NDM-1目的产物,将NDM-1成功克隆入pMD-T,双酶切鉴定见目的条带,重组质粒测序验证了其为NDM-1基因,序列同源性分析显示其与已知NDM-1基因序列高度一致（99.9％）,813碱基中仅第468核苷酸G-A突变,其演绎的氨基酸序列与已知NDM-1完全一致,其序列已登录GenBank,登录号为HQ603057.药敏试验显示此琼氏不动杆菌对除氨曲南、头孢哌酮/舒巴坦外的其他所测试的β内酰胺类抗生素均耐药,但对替加环素、氟喹诺酮、氨基糖苷类敏感.结论 在住院儿童血液中筛查出携带NDM-1琼氏不动杆菌,提示临床试验室应加强亚胺培南耐药革兰阴性杆菌NDM-1基因的筛查,为NDM-1携带菌感染的治疗及防控提供试验依据.

摘要：目的从分离培养的金黄色葡萄球菌中提取肠毒素A(SEA)基因,亚克隆入表达载体pET-28a(+),诱导融合蛋白的表达,为肠毒素A应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEA的序列,设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增SEA,纯化DNA进行BamHⅠ、XholⅠ双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21,并对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌DNA为模板,成功扩增了SEA基因,基因大小为774bp,重组PET-28a(+)-SEA双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEA在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.9%。经IPTG诱导后,SDS-PAGE可见pET-28a(+)-SEA/BL21在相应分子量(约30000Mr)条带大量表达,免疫印迹能检测到目的蛋白条带,说明其与His标签融合表达。结论克隆了金黄色葡萄球菌SEA基因,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为肠毒素A应用研究奠定了基础。

摘要：目的对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)临床分离株携带的ldh-1基因进行克隆、表达,为L-乳酸脱氢酶(L-LDH)功能研究奠定基础。方法根据金黄色葡萄球菌Newman菌株的基因序列,设计一对特异性引物,以MRSA临床分离株(菌株号:1758)DNA为模板PCR扩增ldh-1,纯化DNA进行BamH I、Xhol I双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21,对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。诱导表达后的重组菌经超声破碎离心后,使用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。结果成功构建重组表达质粒pET-28a-ldh1,基因测序结果显示,扩增的ldh1基因全长956 bp,与金黄色葡萄球菌Mu50株ldh1基因的序列同源性为100%。IPTG诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳在39×103Mr处见目的条带,Western blot验证了重组蛋白L-LDH的表达。该蛋白呈可溶性表达,纯化后获得0.5 g/L的重组蛋白。结论在MRSA(菌株号:1758)临床分离株中成功克隆及表达了ldh-1基因,获得了纯化的重组蛋白,为进一步进行L-LDH的功能研究奠定了基础。

摘要：目的在原核质粒中克隆金黄色葡萄球菌(***)Esx A基因,并进行表达及纯化,为其功能研究奠定基础。方法根据Gene Bank中*** Esx A序列,设计特异性引物PCR扩增Esx A基因,PCR产物纯化后经Eco RΙ和XhoΙ双酶切,连接至p ET-28a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,His柱纯化重组Esx A蛋白,SDS-PAGE和Western blot验证重组蛋白的表达。结果成功克隆Esx A基因,基因全长294 bp,起始于ATG,终止于TAA,预测的分子量为11 036.2,等电点为4.61,经双酶切在294 bp处可见目的条带,基因测序显示Esx A在正确阅读框内,提示重组蛋白构建成功。SDS-PAGE显示重组蛋白在分子量大约14.5×103 Mr处左右见到可溶性的蛋白表达,Western blot分析识别14.5×103 Mr重组蛋白。结论在大肠杆菌中成功克隆表达Esx A蛋白,为其功能研究奠定基础。

摘要：目的在大肠杆菌中克隆、表达金黄色葡萄球菌氨基糖苷类耐药基因:腺苷酰转移酶基因,为其功能研究奠定基础。方法按金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶蛋白编码序列设计引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,扩增腺苷酰转移酶基因。将所得片段与p GEX-4t-1(+)载体连接,转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3),提取质粒进行双酶切及测序鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE及Western-blot对重组蛋白进行鉴定。结果使用金黄色葡萄球菌基因组为模板,成功扩增约800 bp目的片段,重组质粒双酶切见目的片段,测序显示腺苷酰转移酶基因长783 bp,启始于ATG,终止于TAG,预测的等电点及分子量分别为7.75、28975.44,目的基因与Genbank金葡腺苷酰转移酶同源性为99%,SDS-PAGE及Western-blot显示在55 k D左右见重组蛋白表达。结论在大肠杆菌中成功克隆、表达了金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶基因,为其功能研究提供了物质基础。

摘要：目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEB的基因序列,设计一对分别含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEB基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEB双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEB在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEB/BL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEB基因,并成功在大肠杆菌BL21中以包涵体形式表达,为肠毒素B应用研究奠定了基础。