摘要：【目的】建立猪捷申病毒(PTV)反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的检测方法,并应用于广西猪群PTV感染诊断。【方法】通过对GenBank中登录的PTV不同血清型基因序列,在5’端保守区设计一对特异性引物,经退火温度摸索及特异性和敏感性试验,建立PTV的RT-PCR检测方法,并对广西部分猪场腹泻病例进行猪捷申病的感染诊断。【结果】所建立的方法能特异性地扩增PTV,不能扩增猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒、猪丁型冠状病毒。建立的方法具有较高的敏感性,可检测低至1.16 pg/μl的质粒模板及12.15 pg/μl的核酸模板。应用建立的RT-PCR方法对2018年3月-2019年4月从广西部分猪场采集的235份病猪腹泻粪便进行PTV临床检测,PTV阳性为24份,阳性率为10.21%。【结论】建立的PTV RT-PCR方法简单特异、灵敏度高,可适用于实验室PTV检测诊断。广西部分受检猪场已存在PTV感染,应予以警惕,加强监测与防控。

摘要：为建立猪捷申病毒(PTV)的TaqMan实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,在PTV基因组序列保守区设计引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为阳性标准品,通过优化反应条件,建立了检测PTV的RT-qPCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,该方法仅对PTV出现特异性扩增反应,与猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒等常见猪病毒均无交叉反应。该方法的标准曲线Ct值与4.6×10^(8)~4.6×10_(2)拷贝/μL的质粒浓度范围具有良好线性关系,标准曲线方程为Ct=-3.201×log X+40.527,线性相关系数(R^(2))为0.996,检测下限为4.6×10^(1)拷贝/μL。对不同浓度的pMD18-PTV进行组内与组间重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于4.0%,具有良好的重现性。应用所建立的方法对235份临床猪腹泻样品进行检测,PTV阳性样品32份,样品阳性率为13.62%。本试验建立的RT-qPCR方法为PTV实验室检测及病毒研究分析提供了可靠的技术手段。

摘要：根据GenBank中登录的猪丁型冠状病毒（PDCoV）N基因序列在保守区设计合成特异性引物和TaqMan探针,构建含有PDCoVN基因的重组质粒作为阳性标准品,通过优化各项反应条件,建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验。结果显示,该方法仅对PDCoV出现特异性扩增反应,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。该方法的标准曲线Ct值与2.2×10 9-2.2×10 1copies/L之间的质粒浓度具有良好的线性关系,标准曲线方程为Ct=-3.539×lg X＋38.95,线性相关系数（R2）为1.0,检测下限为2.2 copies/L。对3个不同浓度（2.2×10 2、2.2×10 4、2.2×10 6copies/L）的pMD18-PDCoV-N进行2次重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于1.0%,表明该方法具有良好的重复性。应用建立的方法对64份广西临床腹泻样品进行检测,结果从其中18份样品中检出PDCo V,样品阳性率为28.1%,说明广西猪群存在PDCoV感染。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法为PDCoV的检测和定量分析提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

摘要：近年来,猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)给养猪业造成了较大经济损失。为快速检测PDCoV,针对病毒N基因设计特异引物,建立了PDCoV重组酶介导核酸等温扩增荧光法(RT-RAA)。通过优化引物浓度、反应温度,确定了最佳反应条件,然后进行了特异性和灵敏性试验,并与普通RT-PCR方法进行了比较。结果显示:该方法特异性较好,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪捷申病毒、传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒等猪源病毒无明显交叉反应;反应过程均在39℃恒温条件下完成,用时30 min即可得到扩增结果;反应体系可检测的最低扩增拷贝数为10 copies/μL,敏感性较高;该方法检测68份猪源病毒样品的PDCoV阳性检出率为17.6%,高于普通RTPCR(13.2%)。结果表明,本研究建立的RT-RAA快速检测PDCoV方法具有快速、特异、灵敏的优点,可用于PDCoV的快速检测和流行病学监测。