摘要：目的:构建含有增强型青色荧光蛋白-尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)作用底物(substrate)-黄色荧光蛋白变体(YPet)融合蛋白的真核表达载体(ECFP-uPA substrate-linker-YPet),即uPA的生物传感器。方法:以Src-biosensor为模板,Primer Premier 5.0软件设计YPet引物,设计时5′端引入uPA底物序列及Linker,两端连接酶切位点及保护碱基。以pMDTM-18T为中间载体,通过基因工程方法构建含有ECFP-uPA substrate-linker-YPet的真核表达载体。然后转染293T细胞,24h后观察转染效率和融合蛋白表达情况,在荧光显微镜下,应用MetaFlour FRET 4.6软件观察并测量uPA生物传感器荧光共振能量转移(FRET)。结果:经过PCR和双酶切鉴定,克隆片段和酶切片段均与uPA substrate分子大小相符。细胞转染后转染效率达40%。免疫荧光检测,uPA生物传感器在293T细胞膜表达,用重组人uPA(rhuPA)刺激转染细胞可以检测到FRET现象。结论:成功构建uPA生物传感器,该生物传感器能够作为活细胞分子探针用于研究uPA的时空变化。