摘要：建立一种基于环介导等温扩增(LAMP)检测利什曼原虫的方法,为内脏利什曼病防治提供技术支持。根据利什曼原虫动基体5.8S核糖体RNA (GenBank:OP829811)序列,设计合成LAMP扩增特异性引物,建立LAMP法。用LAMP法检测恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫感染者和健康人血样DNA,以及日本血吸虫、刚地弓形虫和杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA,评价LAMP法的特异性评价特异性;杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA稀释为1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl,确定LAMP法的最低检测限及有、无钙黄绿素对检测限的影响。用建立的LAMP法和实时荧光定量PCR (qPCR)检测不明原因发热患者和健康人血样;取阳性患者骨髓涂片吉氏染色后镜检,查找利什曼原虫无鞭毛体。建立的LAMP法可检出杜氏利什曼原虫DNA,反应结果呈绿色;检测4种疟原虫感染者和健康人血样以及日本血吸虫、刚地弓形虫DNA的结果均为阴性,呈橙色。LAMP法检测健康人血样46份,均呈阴性,无交叉反应,特异性高。65℃反应60 min,未加和加钙黄绿素的检出限分别为1 pg/μl和1 ng/μl,浊度速率峰值均值分别为0.194、0.120,加钙黄绿素后出现浊度时间较未加钙黄绿素平均延迟23.6 min。LAMP法和qPCR法检测发热患者血样67份的结果一致,均检出相同的2份阳性,2份阳性血样对应的骨髓涂片镜检均查见利什曼原虫无鞭毛体。本研究建立的了检测利什曼原虫的LAMP法操作简便、灵敏度和特异性均较高,检测结果可视,具有较好的推广应用价值。

摘要：目的采用环介导等温扩增(LAMP)方法检测疟原虫DNA,并评价其检测效果。方法采集2013-2018年从疟疾流行区回国人员中确诊为疟疾患者的滤纸血样。根据疟原虫的18S r RNA序列,使用PrimerExplorer V5软件设计恶性疟原虫与非恶性疟原虫LAMP引物,建立疟原虫LAMP检测方法,进行敏感性、特异性、灵敏度和扩增效率评价,并与巢式PCR比较。检测钙黄绿素指示剂对LAMP反应的影响。结果LAMP和巢式PCR各检测96份疟疾患者血样(47份恶性疟血样和49份其他疟疾血样),均检出93份疟原虫阳性。LAMP检测结果显示,恶性疟血样均被检出,非恶性疟假阴性率为2.1%, 10份利什曼原虫玻片血、8份日本血吸虫感染兔血和38份健康人血均为阴性,与巢式PCR检测结果具有极高的一致性(Kappa值=0.956)。LAMP检测恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫的灵敏度分别为25、3、4、2个疟原虫/μl血。扩增效率检测结果显示,4种疟原虫LAMP反应出现浊度时间(Tt值)均小于60 min,速率曲线峰值(Df)达0.14以上,其中恶性疟原虫扩增效率较高,Tt值为20.4 min, Df达0.16。可视化LAMP检测结果显示,钙黄绿素指示剂对不同种疟原虫LAMP反应延时约8~22 min, Df下降约21%~35%。结论 LAMP技术检测疟原虫有高度敏感性、特异性和灵敏度,且可视,具有在现场及基层医疗机构应用前景。

摘要：2022年于卫氏并殖吸虫流行区湖北兴山县和保康县分别采集34只和27只溪蟹,捣碎后用NaOH消化法提取DNA。根据卫氏并殖吸虫5.8S核糖体RNA序列,使用Primer Explorer V5软件设计卫氏并殖吸虫环介导等温扩增(LAMP)特异引物,建立卫氏并殖吸虫LAMP检测方法,评价该方法的特异性、灵敏度、扩增效率及现场应用效果,并与沉淀镜检法比较。结果显示,建立的LAMP检出限可达1个卫氏并殖吸虫囊蚴,且与日本血吸虫、华支睾吸虫、肝片形吸虫、肝毛细线虫、钩虫等虫种无交叉反应。检测4份卫氏并殖吸虫囊蚴DNA样品,出现浊度时间(Tt值)和浊度速率峰值(Df)均值为29.0 min和0.237。LAMP检出兴山和保康县卫氏并殖吸虫阳性溪蟹分别为24只和0只,阳性率分别为70.6%(24/34)和0(0/27);沉淀镜检法检出囊蚴阳性溪蟹分别为23只和0只,阳性率分别为67.6%(23/34)和0(0/27),两种方法结果差异无统计学意义(χ^(2)=0.2,P>0.05)。建立的卫氏并殖吸虫LAMP检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高,可用于淡水蟹卫氏并殖吸虫流行区现场调查或筛查。

摘要：目的建立PCR-RFLP方法检测疟原虫,并评价其应用效果。方法收集2010-2018年武汉市输入性疟疾患者血样。根据4种人疟原虫线粒体细胞色素b(Cytb)基因属、种特异位点,设计1组疟原虫属特异性公共引物。提取患者血样中的疟原虫DNA,巢式PCR扩增得到产物后,用限制性内切酶AluⅠ进行酶切,不同种疟原虫将产生特异性的酶切条带,建立PCR-RFLP检测方法。分析该方法的灵敏度和特异度,并与巢式PCR相比较,评价其应用价值。结果PCR-RFLP检测恶性疟、三日疟、间日疟和卵形疟血样(包括curtisi亚种和wallikeri亚种),最低检出阈值分别为2.5、2、3.6、4、1.5个虫/μL血。共检测121份疟疾血样和45份健康人血样,巢式PCR检出阳性115份,PCR-RFLP方法检出阳性118份,灵敏度分别为95.0%和97.5%,结果一致性较好(Kappa值=0.93),差异无统计学意义(χ2=0.8,P>0.05)。PCR-RFLP分别检测日本血吸虫、利氏曼原虫、隐孢子虫样品无任何扩增条带产生,均为阴性。结论建立的PCR-RFLP方法实验流程相对简单,且检出阈值低,敏感度、特异度高,检测结果易于判断,是一种新的疟原虫核酸检测方法。