摘要：本文基于计算机辅助技术提出了一种利用CT数据和牙石膏模型数据系统化的口腔种植导板设计方法。通过分析患者的CT数据,利用图像处理技术规划种植区域,并对于一个指定的种植区域,提出解剖学意义上的种植体合理分配方法。该方法在考虑生物力学原理以及美观和功能的前提下,能够充分利用患者可用的骨质和骨量,确定种植轴线的最佳位置。然后将CT模型和牙石膏模型配准,实现种植规划向患者口腔的转移。最后以一名患者为试验对象,完成了整个种植导板设计过程,从而验证了本方法的正确性和可行性,这对于提高种植手术的质量与精度具有重要意义。

摘要：目的:针对β-连环蛋白(β-catenin)基因的不同部位,构建靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒,鉴定并筛选出最佳抑制效率的表达质粒。方法:针对β-catenin基因的不同部位设计3对短发卡RNA(shRNA)的寡核苷酸片段,克隆到真核表达载体pGPU6中,构建靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒pGPU6-β-catenin-shRNA-1、2、3。利用脂质体转染人胃癌细胞株AGS,Western blot法检测并筛选最佳抑制效率的shRNA表达质粒。结果:3个靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒pGPU6-β-catenin-shRNA-1、2、3经限制性酶切和测序确实基因插入正确,Westernblot法证实pGPU6-β-catenin-shRNA-3明显降低细胞内β-catenin蛋白的表达。结论:成功构建了靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒pGPU6-β-catenin-shRNA-1、2、3,并筛选出最佳抑制效率的表达质粒,为进一步研究Wnt/β-catenin信号通路在胃癌中的作用奠定了基础。

摘要：目的构建肿瘤增殖基因Ki-67小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人肾癌细胞Ki-67基因表达的阻抑作用,探索肾癌基因治疗新的途径。方法设计有小发夹机构的2条Ki-67siRNA对应模板DNA序列,煺火处理后克隆至pSliencer3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-Ki-67。将pSliencer-Ki-67转染人肾癌786-0细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Westernblot检测Ki-67表达。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-Ki-67构建成功。其可显著抑制786-0细胞Ki-67mRNA、Ki-67蛋白表达。结论成功构建的Ki-67siRNA表达质粒pSliencer-Ki-67能抑制人肾癌786-0细胞Ki-67基因表达。

摘要：目的探讨小RNA干扰靶向抑制Par-4基因表达对人骨髓间充质干细胞凋亡的影响。方法原代培养人骨髓间充质干细胞，谷氨酸诱导凋亡。设计和合成针对Par-4基因mRNA的siRNA（Par-4-siRNA），构建真核细胞表达载体，用脂质体介导转染人骨髓间充质干细胞，利用G418筛选稳定表达细胞株。实时荧光定量PCR（real-timePCR）法检测Par-4mRNA的表达量。流式细胞术测定细胞凋亡百分率。Western blot测定磷酸化（Thr308）的蛋白激酶Aktl蛋白表达量。比色法测定Caspase-3酶活性。结果筛选出的Par4-SiRNA-1、2显著抑制人骨髓间充质干细胞中Par-4基因的mRNA表达，mRNA水平分别降低88％、67％。在谷氨酸诱导后24h，人骨髓间充质干细胞发生凋亡，百分率为60．30％±6．82％。Par-4-SiRNA-1、2都显著抑制谷氨酸的诱导作用，凋亡百分率降为38．80％±3．97％（P〈0．01）和45．49％±4．32％（P〈0．01）。谷氨酸诱导后24h人骨髓间充质干细胞中磷酸化Aktl蛋白表达下调（89．074-6．42和28．30±5．65，P〈0．叭），而Par-4-SiRNA-1、2对之下调都有显著抑制作用（63．564-6．75和45．59±4．88，均有P〈0．01）。谷氨酸诱导后24h人骨髓间充质干细胞中Caspase-3酶活性上调（0．1428±0．0495和0．8616±0．1051，P〈0．01），而Par-4-SiRNA-1、2对之上调都有显著抑制作用（0．6581±0．0555和0．7041±0．0401，均有P〈0．01）。结论小RNA干扰可靶向抑制Par-4基因的表达，拮抗谷氨酸诱导的人骨髓间充质干细胞的凋亡。

摘要：目的:建立稳定、高表达鼠转录因子Hlx的树突状细胞系DC2.4/mHlx。方法:参照GenBank中mHlx基因序列,设计mHlxCDS全长引物;以PGEM-T/mHlx质粒为模板,通过PCR获得目的基因,再克隆到PIRES2-EGFP真核表达载体,经PCR、酶切鉴定后进行序列测定,用脂质体转染DC2.4;应用G418筛选出耐药克隆,有限稀释法进行单克隆。通过观察EGFP的表达选定单克隆细胞株,再用流式细胞术分析、Real-time PCR和Western blot进行鉴定。结果:构建了PIRES2-mHlx-EGFP真核表达载体,并成功建立mHlx修饰和EGFP修饰的细胞系(DC2.4/mHlx和DC2.4/EGFP)。结论:成功建立稳定高表达mHlx的树突状细胞系DC2.4/mHlx,为深入探讨mHlx功能构建了平台,为Hlx修饰后的树突状细胞作为工具细胞的应用奠定了基础。

摘要：目的:建立纳米金辅助不对称PCR方法扩增幽门螺杆菌23S rRNA基因,为建立基因芯片法检测幽门螺杆菌耐药基因提供试验平台。方法:将幽门螺杆菌23S rRNA基因转化至感受态大肠杆菌JM109,小量抽提阳性构建质粒DNA,以质粒DNA为模板,设计引物对23S rRNA基因进行不对称PCR扩增。对PCR条件中引物浓度及浓度比例、纳米金浓度等进行优化。结果:限制性引物与非限制性引物浓度比例为1∶60,限制性引物与非限制性引物浓度分别为0.04pmol/L、2.4pmol/L时可获得理想的单链和双链DNA,纳米金浓度为0.8nmol/L时非特异性产物最少,PCR的扩增效率最高。结论:通过对PCR扩增条件的优化,确立了扩增幽门螺杆菌23S rRNA基因纳米金辅助不对称PCR方法的最佳条件,为建立基因芯片法检测幽门螺杆菌耐药基因奠定基础。

摘要：背景:目前已有很多实验证明外周血中存在间充质干细胞,但由于所用分离筛选方法、培养条件的不同导致了结果的多样性,且实验可重复性较差。目的:观察表皮生长因子对体外分离培养的原代小鼠外周血间充质干细胞克隆形成的影响,以及外周血间充质干细胞传代后的多向分化潜能。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-10/2008-09在南京医科大学骨与干细胞研究中心完成。材料:雄性成年C57BL/6J小鼠16只,购于南京医科大学骨与干细胞研究中心实验动物中心。重组人表皮生长因子为Sigma公司产品。方法:无菌条件下从小鼠心脏采血,裂解红细胞后应用贴壁法分离外周血间充质干细胞,通过传代进行纯化和扩增。将原代细胞分2组进行体外培养,实验组向α-MEM培养液中加入10μg/L表皮生长因子,对照组给予不含表皮生长因子的α-MEM培养液,16d后行亚甲基蓝染色,计算克隆面积。取第3代外周血间充质干细胞,以1×104/cm2密度接种后,分别向成骨和脂肪方向诱导分化。主要观察指标:外周血间充质干细胞的生长特性,外周血间充质干细胞体外诱导成骨、成脂能力。结果:倒置相差显微镜下,外周血间充质干细胞贴壁生长,形态类似于骨髓间充质干细胞,呈成纤维细胞样;但其形成克隆的时间较骨髓间充质干细胞有所推迟,且原代细胞克隆形成率低于骨髓间充质干细胞;亚甲基蓝染色结果示实验组外周血间充质干细胞克隆形成率明显高于对照组(P<0.05)。外周血间充质干细胞成骨诱导后,碱性磷酸酶染色、总胶原染色及茜素红染色均呈强阳性;成脂诱导后油红染色呈阳性,有一定数量的脂滴形成。结论:外周血中存在少量的间充质干细胞,能自我增殖,表皮生长因子可有效促进原代外周血间充质干细胞克隆的形成;体外分离培养的外周血间充质干细胞具备成骨和成脂分化特性。

摘要：背景与目的:研究发现survivin基因参与了包括膀胱癌在内的人类多种肿瘤的发生。近期研究表明survivin的异构体同样具有独特的亚分子定位和功能。本研究通过检测survivin及其异构体survivin-2B和survivin-△Ex3mRNA在膀胱癌组织中的表达,探讨这两个异构体潜在的临床意义。方法:选取手术切除的原发膀胱移行细胞癌(bladder transitional cell carcinoma,BTCC)新鲜标本60例,膀胱良性疾病患者病变膀胱组织标本12例作为对照。应用实时定量PCR方法检测survivin、survivin-2B和survivin-△Ex3mRNA的表达量,分析其表达与不同病理分级和临床分期膀胱癌的关系。结果:Survivin、survivin-2B和survivin-△Ex3mRNA在BTCC组织中均存在表达,表达量分别为0.333±0.163、0.056±0.017、0.124±0.096;对照组12例均表达survivin-2B mRNA,其中分别有3例和4例标本存在survivin和survivin-△Ex3mRNA的微量表达。Survivin和survivin-△Ex3mRNA的表达与病理分级和临床分期呈正相关(0<r's<1,P<0.05),survivin-2B呈负相关(-1<r's<0,P<0.05)。3例复发患者原膀胱肿瘤组织中survivin mRNA的表达较相同病理级别者明显高,而survivin-2B却低。结论:检测survivin及其异构体survivin-2B和survivin-△Ex3mRNA在BTCC组织中的表达,对判断膀胱肿瘤的恶性程度以及术后复发具有潜在的临床应用价值。

摘要：目的合成N-乳糖酰壳聚糖作为肝靶向载体,制备去甲斑蝥素纳米粒。方法通过碳二亚胺缩合法制备N-乳糖酰壳聚糖,并以之为载体,采用离子诱导法制备去甲斑蝥素N-乳糖酰壳聚糖纳米粒。以粒径分布、包封率、载药量为综合指标,正交试验设计优化载药纳米粒的制备工艺,并考察其体外释放特性。结果合成的N-乳糖酰壳聚糖的取代度为8.92%。优化工艺制备的N-乳糖酰壳聚糖载药纳米外观圆整,平均粒径(118.7±8.84)nm,包封率(57.92±0.40)%,载药量(10.38±0.06)%,其体外释药遵循Higuchi方程。结论半乳糖修饰壳聚糖载药纳米粒具有良好的缓释特性。

摘要：目的建立实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测协同刺激分子B7-H4基因表达的方法。方法采用自行设计的检测协同刺激分子B7-H4及内参照基因GAPDH的引物及TaqMan探针，经优化反应体系及反应条件后，检测B7-H4及GAPDH的基因表达。将B7-H4和内参照基因GAPDH的PCR扩增产物经测序鉴定正确并纯化后分别与pMDl9-T载体连接，克隆构建含B7-H4及GAPDH基因片段的重组质粒，作为实时荧光定量PCR检测B7-H4及GAPDH基因表达的标准品。将重组质粒标准品进行定量及梯度稀释，建立标准曲线。结果PCR扩增产物分别经测序证实为B7-H4及GAPDH基因的特异性片段。该法检测B7-H4基因表达的灵敏度为527copies／ml，线性范围为5．27X×10^2～5．27×10^7copies／ml，标准曲线方程为：Y=-3．1395X＋41．805，直线回归相关系数r=0．995，批间变异系数范围为2．39％～3．59％，扩增效率108．2％。该法检测GAPDH基因表达的灵敏度为386copies／ml，线性范围为3．86×10^2～3．86×10^7 copies／ml，标准曲线方程为：Y=-3．2436X＋41．083，直线回归相关系数r=0．999，批间变异系数范围为2．26％～3．86％，扩增效率103．4％。结论成功构建实时荧光定量PCR检测协同刺激分子B7-H4基因表达的方法，该方法特异性好、灵敏度高、重复性好。