摘要：背景:瘦素作为一种内分泌激素参与机体能量代谢的调节,近年来瘦素对骨代谢的调节作用也越来越被人们所重视。目的:克隆人Leptin基因,构建重组原核表达载体PEGX-5X-3/Leptin并在大肠杆菌中表达,观察Leptin融合蛋白对人成骨细胞的生长抑制作用。设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-07/2008-05在苏州大学附属第一医院骨科实验室完成。材料:新鲜的脂肪组织取自苏州大学附一院(供者知情并同意)、大肠杆菌DH5α、人成骨细胞由苏州大学附属第一医院骨科实验室保种。方法:从人脂肪组织中提取RNA,采用反转录-聚合酶链式反应获得人Leptin全部序列,克隆入带有GST原核细胞表达载体PEGX-5X-3中,实现插入基因的融和表达,用SDS-PAGE和WesternBlot对表达产物进行鉴定,提取并纯化GST-Leptin融合蛋白,以5,10,20,40mg/L不同质量浓度与人成骨细胞共培养,同时设立相应浓度梯度的GST蛋白组,四甲基偶氮唑盐法测两组人成骨细胞的体外增殖情况。主要观察指标:①Leptin基因的克隆与鉴定。②重组质粒的双酶切及聚合酶链反应鉴定。③融合蛋白的表达。④GST-Leptin融合蛋白的纯化。⑤GST-Leptin融合蛋白的鉴定。⑥GST-Leptin融合蛋白对人成骨细胞的生长影响。结果:反转录-聚合酶链反应扩增得到的特异性片段长度约为450bp,以此构建的重组质粒PEGX-5X-3/Leptin,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后显示5kb和450bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中报道的完全一致,证明Leptin基因已成功地克隆到了原核表达载体PEGX-5X-3中。并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致,融合蛋白为Mr45000,GST蛋白为Mr29000,与GST蛋白组相比,20,40mg/L的GST-Leptin融合蛋白可以明显促进细胞的生长(P<0.05),且其促进作用有一定的浓度依赖性。结论:成功构建了PEGX-5X-3/Leptin重组原核表达载体,在***21中表达GST-Leptin融合蛋白,并以浓度依赖性促进人成骨细胞的生长。

摘要：目的构建卷曲蛋白跨膜受体7（FZD7）基因启动子，并分析其肝癌特异性转录调控活性。方法构建FZD7启动子及FZD7启动子变异体（MutFZD7），并设计合成荧光报告载体pFZD7-绿色荧光蛋白（GFP）、MutpFZD7-GFP。将各重组质粒载体转染至肝癌细胞HepG2、SMMC7721及正常肝细胞1．02中，用荧光显微镜和流式细胞仪检测GFP的表达。在裸鼠肝癌移植瘤模型瘤体内注射各重组质粒后，制备肿瘤组织冰冻切片并在荧光显微镜下观察GFP表达。结果转染pFZD7-GFP的肝癌细胞HepG2和SMMC7721中均有高强度荧光，且GFP表达率分别为（45．1±3．1）％和（25．3±2．5）％，显著高于L02细胞的GFP表达率[（0．4±0．3）％，P〈0．05]；而转染MutpFZD7-GFP的HepG2、SMMC7721和L02细胞中荧光强度明显较弱，且GFP表达率分别为（21．5±2．7）％、（12．3±2．1）％和（0．2±0．1）％，均显著低于转染pFZD7-GFP的各对应组（P〈0．05）；对照组中，转染对照质粒pFZD7-Luc的肝癌细胞及L02细胞中未检测到GFP的表达，而转染对照质粒pEGFP-N1的各细胞株中均有大量细胞表达GFP。在裸鼠肝癌移植瘤中有相似的结果。结论FZD7启动子具有高度的肝癌特异性活性，T细胞因子／淋巴增强因子（TCF／LEF）转录因子结合位点在其转录调控中发挥关键作用。