摘要：目的构建解脲支原体Ferritin蛋白的原核表达载体,纯化重组Ferritin蛋白并测定其抗氧化功能,为解析解脲支原体的抗氧化机制奠定基础。方法利用荧光定量PCR检测氧化胁迫下Ferritin基因的相对表达量。根据Ferritin基因序列,设计引物,PCR扩增Ferritin全长片段。将解脲支原体Ferritin基因中编码色氨酸的密码子TGA突变为TGG,将突变后的Ferritin基因连接到原核表达载pET28a得到重组质粒pET28a-Ferritin,转化大肠埃希菌BL21(DE3)得到重组菌BL/pET28a-Ferritin,IPTG诱导Ferritin蛋白表达并用镍柱亲和层析进行纯化。体外试验测定Ferritin蛋白的Fe2+结合特性,亚铁氧化酶活性和抗氧化能力。结果 Ferritin基因在H2O2或者CHP胁迫表达上调。成功构建能够表达全长Ferritin蛋白的重组质粒pET28a-Ferritin。诱导并纯化得到理论分子质量单位为22ku的重组Ferritin蛋白。结合Fe2+后,Ferritin蛋白的内源荧光值降低。Ferritin具有Fe2+氧化酶活性,能催化Fe2+生成Fe3+,并能够减少氧自由基的产生。结论解脲支原体Ferritin基因在氧化胁迫条件下表达上调,其表达产物具有亚铁氧化酶活性和抗氧化功能。

摘要：目的:构建B群脑膜炎奈瑟菌pc DNA3.1(+)/NMB0315真核表达重组质粒,检测其诱导小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平、免疫血清体外杀菌效果及免疫保护作用,初步探讨NMB0315核酸疫苗的免疫活性和免疫保护效果,为研制一种新的预防B群流脑的核酸疫苗提供实验依据。方法:以B群脑膜炎奈瑟菌标准株MC58基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增NMB0315基因,克隆至pc DNA3.1(+)真核表达载体中,经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切及测序鉴定重组质粒。构建成功的pc DNA3.1(+)/NMB0315重组质粒转染COS-7细胞和RAW264.7细胞,免疫细胞化学染色法和Western blot法检测重组蛋白在真核细胞中的表达。大量提取重组质粒,肌注免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内抗NMB0315的特异性体液免疫和细胞免疫水平;测定免疫血清体外杀菌滴度,观察核酸疫苗对实验小鼠的免疫保护效果。结果:构建的核酸疫苗pc DNA3.1(+)/NMB0315能够在真核细胞中有效转录和表达;免疫小鼠后能诱导产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。在疫苗免疫后的2、4、6周,pc DNA3.1(+)/NMB0315组和pc DNA3.1(+)/NMB0315+Cp G组血清总Ig G及Ig G1、Ig G2a、Ig G2b和Ig G3亚类抗体水平呈递增趋势,均明显高于PBS、pc DNA3.1(+)、Cp G对照组(P<0.001);小鼠血清Ig G2a/Ig G1比值均小于1;生殖道灌洗液中特异性s Ig A水平均明显高于PBS、pc DNA3.1(+)、Cp G对照组(P<0.01)。免疫第6周,脾淋巴细胞刺激指数(SI)均明显高于对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。pc DNA3.1(+)/NMB0315+Cp G、pc DNA3.1(+)/NMB0315疫苗组免疫血清补体介导的体外杀菌效价分别为1∶128和1∶64;在致死量B群脑膜炎奈瑟菌MC58攻击后72 h存活率分别为70%和65%,对照组[PBS,pc DNA3.1(+),Cp G]72 h存活率为0。结论:NMB0315核酸疫苗能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫(包括黏膜免疫)和细胞免疫应答;免疫血清补体介导的体外杀菌活性较高;NMB0315核酸疫苗对感染B群脑膜炎奈瑟菌小鼠具有较强的免疫保护作用。

摘要：目的表达香港海鸥菌(Laribacter hongkongensis)分子伴侣蛋白HdeA并鉴定其保护功能,为解析其抗酸机制奠定基础。方法通过与相关蛋白进行同源性比较,在香港海鸥菌中找出编码HdeA的基因。以HdeA基因序列为基础,设计特异性引物,PCR扩增HdeA基因,并将其连接到表达载体pET28a,构建的重组质粒pET28a-HdeA转化大肠埃希菌BL21(DE3),得到重组菌BL/pET28a-HdeA,用IPTG诱导表达目的蛋白并利用镍柱亲和层析纯化HdeA蛋白,采用光散射法分析HdeA蛋白的保护功能。结果通过Blast分析,从香港海鸥菌中找到编码HdeA的基因。以合成的特异性引物扩增出约315bp的HdeA片段,连接到原核表达载体pET28a后转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导成功表达出HdeA蛋白,其分子质量单位为14.1ku,与理论值相符合。经His-tag亲和层析纯化,获得纯度较高的重组HdeA蛋白。光散射法检测分析HdeA蛋白能够减轻酸性条件下ADH蛋白聚集。结论纯化的重组HdeA蛋白在体外具有抗酸功能,为研究香港海鸥菌的抗酸机制奠定了基础。

摘要：沙眼衣原体是一种严格细胞内寄生的病原体,也是最常见的性传播疾病病原体,可感染人类多个系统引起多种疾病而影响人类健康。沙眼衣原体具有独特的发育周期,黏附和入侵宿主细胞是它感染过程中的关键步骤,首先通过与宿主细胞的静电作用达到简单吸附,随后由自身黏附素分子与宿主细胞相应受体结合达到不可逆结合,而后通过分泌毒力因子劫持宿主细胞骨架的必需成分或信号通路内化入胞。病原体和宿主因素共同参与沙眼衣原体黏附和入侵过程,掌握黏附和入侵过程中有关的细菌和宿主因素有望设计针沙眼衣原体的抗菌策略。本文从宿主和病原体两个方面阐述沙眼衣原体黏附和入侵宿主相关机制。

摘要：[目的]克隆沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)LpxA基因并分析其生物学特性。[方法]根据Ct LpxA基因序列设计特异性引物,利用PCR扩增LpxA基因,并把LpxA基因连接到p MD18-T载体,挑取阳性克隆进行PCR和DNA测序验证。最后使用生物信息学软件分析LpxA蛋白的生物学性质。[结果]从Ct基因组中PCR扩增得到840 bp的Ct LpxA基因,该基因共编码280个氨基酸。LpxA蛋白无信号肽,定位在细菌细胞质。二级结构预测得知α-螺旋占19.6%,延伸链占32.8%,β-转角为11.4%,无规卷曲为36%。三级结构预测得知3个相同的LpxA分子组成同源三聚体。预测得知LpxA蛋白有11个B细胞表位。[结论]克隆得到Ct LpxA基因,并预测了其结构和功能。

摘要：目的原核表达、纯化肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)Tpx蛋白并测定其活性。方法利用生物信息学方法分析Tpx蛋白的生物学特性。设计特异性引物,PCR扩增Tpx基因并对进行双酶切,酶切片段连接到表达质粒pET28a。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),利用IPTG诱导重组Tpx蛋白表达,使用Ni 2+亲和层析进行纯化,采用氧化铁二甲酚橙法(FOX)测定其活性。结果生物信息学分析Tpx蛋白无信号肽,无跨膜结构域。α-螺旋、延伸主链、β-转角和无规卷曲的含量分别为30%、27.6%、11.6和30.7%。晶体结构在蛋白结构数据库(PDB)中的登陆号为1psq.1.A。PCR扩增Tpx基因片段大小为492bp,连接到pET28a后获得重组质粒pET28a-Tpx。重组质粒转化DE3后经IPTG诱导表达分子质量单位约为22ku的重组蛋白,经亲和层析得到高纯度的重组Tpx蛋白,该蛋白能分解H2O2和叔丁基过氧化氢(t-BHP)。结论成功构建pET28a-Tpx质粒,表达的重组Tpx蛋白具有氧化酶活性,为研究肺炎链球菌的抗氧化机制奠定了实验基础。

摘要：衣原体(Chlamydia)是一种专性胞内寄生菌,衣原体的反复感染及其诱发的严重后遗症是人类健康的巨大威胁,因此,迫切需要开发安全有效的疫苗来预防和控制衣原体感染。尽管人类在衣原体免疫保护机制的研究和疫苗开发方面已经取得了一定的突破,但是结合疫苗安全性和免疫效果的全面考量,有效衣原体疫苗的成功出世仍然面临很多问题。本文就疫苗免疫效果的影响因素、合理设计有效衣原体疫苗的要素以及减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、树突状细胞(dendritic cells,DC)疫苗和菌影(bacterial ghost,BG)疫苗等衣原体疫苗的研究现状进行简要论述。

摘要：本研究根据Ct Ahpc基因序列设计特异性引物,以Ct DNA为模版PCR扩增Ahpc基因到大小为585 bp,将其连接到p ET28a获得重组质粒p ET28a-Ahpc,将该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌BL/p ET28a-Ahpc,利用IPTG诱导重组Ahpc蛋白表达,目的蛋白分子量大小约为26 k D。利用Ni-NAT亲和层析法纯化得到的重组Ahpc蛋白。氧化铁二甲酚橙法检测发现Ahpc蛋白能够分解双氧水和叔丁基过氧化氢,具有分解过氧化合物的活性。测定重组大肠杆菌在百草枯所致氧化胁迫下的生长曲线,发现表达Ahpc蛋白的重组菌的生长情况比对照好。本研究成功表达和纯化得到沙眼衣原体Ahpc蛋白并测定其活性,为解析沙眼衣原体的抗氧化机制提供实验证据。

摘要：目的原核表达并纯化人型支原体(Mycoplasma hominis,Mh)毒力相关蛋白D(Virulence-associated protein,VapD)。方法从GenBank查找Mh VapD基因序列,设计引物并进行优化,合成VapD片段并以此为模板,PCR扩增VapD,然后用EcoRI和XhoI进行双酶切并连接表达载体pET28a,构建原核重组质粒pET28a-VapD,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,重组产物经镍柱亲和层析纯化。结果合成的VapD基因全长为303bp,连接原核表达载体pET28a得到重组质粒pET28a-VapD。重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达分子质量标准为15ku的重组Mh VapD蛋白,与理论分子质量大小相符合。VapD蛋白具有可溶性,纯化后的目的蛋白电泳检测为单一条带。结论成功构建原核重组载体pET28a-VapD并纯化获得VapD蛋白,为进一步研究VapD蛋白的致病机制奠定了基础。

摘要：目的:鉴定沙眼衣原体pORF5质粒蛋白的免疫原性,并进一步筛选和确定pORF5质粒蛋白免疫优势片段。方法:以沙眼衣原体D血清型DNA为模板,设计pORF5基因全长和9个不同片段特异引物进行PCR扩增,PCR产物经Bam HⅠ、NotⅠ双酶切后插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX-6p中,构建pORF5质粒蛋白不同长度片段的原核表达重组体,重组体经PCR和测序鉴定后,转化XL1 Blue大肠杆菌表达10种不同长度的GST融合蛋白;ELISA方法检测pORF5质粒蛋白的免疫原性,Western blot鉴定pORF5质粒蛋白的免疫反应性;ELISA测定10个不同片段与沙眼衣原体生殖道感染患者血清、鼠免疫血清以及抗pORF5单克隆抗体的免疫反应性,鉴定pORF5质粒蛋白免疫优势片段。结果:pORF5质粒蛋白免疫原性强,能刺激机体产生高效价抗体;破坏pORF5质粒蛋白天然空间结构,其免疫反应性基本消失;在ELISA反应中,N端缺失66氨基酸的F6片段的免疫反应强度与pORF5全长基本相似,F2与F3出现较弱的免疫反应,其余片段免疫反应消失。结论:pORF5质粒蛋白为构象依赖性免疫优势抗原,其免疫优势表位和构象表位位于C端,本研究为进一步探讨pORF5质粒蛋白的生物学功能和疫苗的研制提供实验依据。