摘要：试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp基因,将目的基因片段与pET-28a载体连接,构建重组原核表达载体。重组菌转化到*** BL21(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达的重组蛋白。结果表明,重组蛋白在诱导剂的终浓度为0.08 mmol·L^-1,16℃,220 r·min^-1诱导7 h,蛋白表达量最高。综上所述,本研究成功构建了pET-28a-Ch Prnp重组表达菌株,为Prnp朊蛋白的结构、生理功能和致病机制研究提供方法。

摘要：本研究旨在对合作猪血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HMOX1)基因进行克隆及分析其相关生物信息学。本试验以NCBI数据库中已知的野猪HMOX1基因mRNA序列为模板设计特异性引物,应用RT-PCR技术扩增得到CDS区全长序列,采用生物信息学分析软件对合作猪HMOX1基因序列特征、同源性以及编码产物的理化性质、二级结构和三级结构、亚细胞定位、潜在信号肽剪切位点、跨膜结构域、亲疏水性、保守结构域、激酶磷酸化修饰位点等进行预测分析。结果表明,合作猪HMOX1基因CDS全长867 bp,编码288个氨基酸,与NCBI中公布的野猪(NM001004027.1)HMOX1基因核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性为99.3%,并发现在第450 bp处T>C为同义突变;第706 bp处A>G和第802 bp处A>G为错义突变,导致第236位和第268位的异亮氨酸均突变为缬氨酸。合作猪与野猪、绵羊、牛、犬、兔、人、猫、马、小鼠、大鼠和鸡的氨基酸同源性分别为99.3%、86.5%、85.5%、84.7%、84.0%、82.6%、82.6%、81.4%、78.9%、77.2%和61.5%;系统进化树分析发现合作猪与野猪亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。合作猪该基因编码产物具有亲水性和不稳定性,二级结构以α-螺旋为主,主要定位于分泌系统囊泡,不存在信号肽剪切位点,属非分泌蛋白;存在一段跨膜螺旋结构,含有一个Hemeoxygenase保守结构域,44个磷酸化修饰位点。本研究成功克隆出合作猪HMOX1基因CDS全长序列,可为今后HMOX1基因在合作猪高海拔低氧胁迫下的适应性分子机制研究提供科学理论依据。

摘要：本试验旨在研究枯草芽孢杆菌(BS)对脂多糖(LPS)应激肉仔鸡生长性能、免疫性能和血清抗氧化性能的影响。选用1日龄健康爱拔益加(AA)肉仔鸡192只(公母各占1/2),采用2×2两因子试验设计,2个因子分别为饲粮(饲喂基础饲粮或添加200 g/t BS的试验饲粮)和LPS应激(口腔灌服LPS溶液或生理盐水),随机分为:1)基础饲粮+生理盐水组;2)基础饲粮+LPS组;3)试验饲粮+生理盐水组;4)试验饲粮+LPS组,共计4个组,每组6个重复,每个重复8只鸡,试验期为28 d,分为3个阶段,包括应激前期(第1~14天)、LPS应激期(第15~21天)、恢复期(第22~28天)。结果表明:1)在第1~14天,饲粮中添加BS可显著提高肉仔鸡平均日增重(ADG)(P0.05)。3)在第21天,在LPS应激条件下,LPS应激显著提高血清中免疫球蛋白G(IgG)的含量(P0.05)。4)在第21天,与基础饲粮组相比,饲粮中添加BS对血清白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量无显著影响(P>0.05)。LPS应激显著提高血清IL-1β、IL-6的含量(P0.05)。5)在第21天,在LPS应激条件下,饲粮中添加BS可显著提高血清总抗氧化能力(T-AOC)(P0.05)。在第28天,LPS应激显著降低血清SOD活性(P0.05)。综上所述,饲粮中添加BS可以缓解免疫应激造成的肉仔鸡生长性能降低,改善血清抗氧化性能,抑制血清炎性细胞因子含量的增加,进而增强机体免疫力,从而减轻LPS应激对动物机体造成的损伤。

摘要：【目的】建立快速高效的细菌性虫媒病的检测方法。【方法】运用反向线状印迹杂交技术(reverse line blot,RLB),通过对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型(Salmonella enterica *** serovar Typhimurium)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)7种细菌的核糖体16S RNA进行序列比对,利用DNAStar和Primer premier软件设计出了用于PCR-RLB杂交反应的基因组DNA样品进行PCR扩增的通用引物(RLB-F,RLB-R),和特异性探针以及通用探针(Catch-all),通用下游引物(RLB-R)5'端用生物素标记和探针5'端连接氨基团(NH_(2)^(+))。【结果】成功建立高效、快速、特异且能同时检测7种细菌PCR-RLB的方法,并确定了通用引物最佳浓度为25μmol/L,金黄色葡萄球菌和福氏志贺菌探针的最佳浓度分别为50μmol/L,其他5种病原探针的最佳浓度为100μmol/L。使用PCR-RLB检测方法,可对上述7种细菌的检测敏感性可达到10^(-6)~10^(-11) ng/μL,远远高于PCR的10^(-3)~10^(-8) ng/μL。【结论】首次同时对7种细菌进行检测,并确定了不同引物及探针的最佳浓度。该方法不仅提高了检测效率,同时还提高了检测的灵敏度,为开发新的检测手段提供了理论依据。