摘要：为了探究苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)基因在细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)生长发育中的生物学功能并初步评价MDH作为疫苗候选抗原的潜力,从NCBI GenBank数据库中获得Eg MDH基因序列,设计特异性引物,以细粒棘球绦虫原头蚴的cDNA为模板,用PCR扩增MDH基因全长序列;采用生物信息学软件对MDH蛋白的理化性质、结构特点等进行分析;构建重组质粒pET28a-MDH并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用SDS-PAGE检测蛋白的表达,随后纯化、复性蛋白,并通过Western-blot对蛋白进行抗原性分析;利用间接免疫荧光试验检测原头蚴中目的蛋白的定位;应用实时荧光定量PCR分析Eg MDH基因m RNA在原头蚴及成虫中的相对转录水平。生物信息学分析结果显示,Eg MDH基因长999 bp,编码332个氨基酸,蛋白分子式为C1639H2599N445O475S16,相对分子质量为36 651.32,理论等电点为8.11,且编码蛋白没有信号肽和跨膜区,含有40个磷酸化位点,3个N连接型糖基化位点,9个优势B细胞抗原表位。二级结构由α-螺旋(46.69%)、无规则卷曲(31.93%)、延伸链结构(16.87%)和β-转角(4.52%)构成。克隆的基因长975 bp,预测分子质量为35.7 ku;Western-blotting显示,重组蛋白可以被抗His标签的家兔多克隆抗体和原头蚴可溶性全蛋白小鼠多克隆抗体识别;间接免疫荧光试验显示,Eg MDH蛋白定位在原头蚴的囊壁;实时荧光定量PCR显示,Eg MDH基因在成虫及原头蚴中均有表达,且原头蚴阶段的转录水平显著高于成虫(P<0.05)。本研究结果初步表明Eg MDH具有作为疫苗候选抗原的潜力,以期为后续细粒棘球绦虫疫苗研发提供候选抗原;同时也为后续细粒棘球绦虫MDH基因的深入研究奠定了基础。

摘要：目的了解细粒棘球绦虫的乳酸脱氢酶蛋白基因的生物信息学特性,并进行原核表达。方法利用NCBI网站登录的细粒棘球绦虫乳酸脱氢酶基因序列设计特异性引物和qRT-PCR引物,使用PCR扩增细粒棘球绦虫乳酸脱氢酶基因,使用荧光定量法检测细粒棘球绦虫乳酸脱氢酶在不同发育阶段的相对表达量,使用生物信息学软件对细粒棘球绦虫乳酸脱氢酶蛋白进行分析;构建重组pET28a-EgLdh质粒,转进大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,利用SDS-PAGE检测蛋白的表达,并通过Western blot对蛋白进行免疫原性分析;利用原核表达重组pET28a-EgLDH蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光分析其在虫体上的分布。结果生物信息学分析发现EgLDH全长996 bp,编码331个氨基酸,分子式为C_(1575)H_(2561)N_(425)O_(470)S_(17),相对分子质量为35516.25,理论等电点为6.32,不稳定指数为27.96,显示为稳定蛋白,脂肪系数为106.83,亲水性为0.236,为疏水性蛋白,有13个潜在的B细胞抗原表位;通过双酶切鉴定及测序分析证明,pET28a-EgLDH重组质粒构建成功。重组质粒pET28a-EgLDH转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞后使用IPTG成功诱导表达蛋白,分子质量约为40 ku,Western blot结果显示,重组蛋白能被感染棘球蚴的犬阳性血清识别,表明其均具有良好的反应原性。EgLDH在细粒棘球绦虫阶段的相对转录水平显著高于原头蚴阶段。间接免疫荧光分析显示其定位在原头蚴的表皮层。结论rEgLDH具有较好的免疫活性,是一种潜在的疫苗候选抗原。

摘要：为研究NDRG1基因在绵羊生长繁殖中的功能,本实验通过克隆NDRG1基因编码区并分别构建过表达和干扰载体,在细胞水平对其功能进行验证。利用RT-PCR扩增绵羊NDRG1基因CDs区,将其克隆至pcDNA3.1(+)载体构建重组表达载体,设计并构建针对NDRG1CDs区干扰载体,利用内切酶消化法对相关质粒进行鉴定。将构建成功的重组载体转染到HEK293T细胞中,分别利用RT-qPCR和Western Blot方法检测其mRNA和蛋白表达量,确认载体功能。结果显示,NDRG1基因克隆片段为1378 bp,与已发布预测的绵羊NDRG1基因进行比对显示在第1031核苷酸位点发生了G-A突变,氨基酸比对结果显示其同源性为100%。酶切鉴定结果显示,NDRG1表达载体和干扰载体构建成功。RT-qPCR与WesternBlot结果表明,构建的重组载体可介导NDRG1基因在HEK 293T细胞中极显著增高,构建的干扰载体可显著降低NDRG1基因表达水平,其中NDRG1-shRNA3干扰效果极显著且高达90%。本实验成功克隆绵羊NDRG1基因,构建针对该基因的表达载体和干扰载体,并在细胞水平验证其功能,为深入研究NDRG1基因在绵羊细胞中的功能提供基础。

摘要：成纤维细胞生长因子5(FGF5)是影响毛囊周期性活动及毛发生长的重要生长因子。本研究利用CRISPR/Cas9n系统靶向编辑绵羊成纤维细胞中FGF5基因。首先利用Gibson Assembly法将U6启动子引导表达单导向RNA(sgRNA)的原件构建至pX461质粒中,获得pX461-U6质粒;再将设计并合成好的1对靶向FGF5基因第3外显子的sgRNA及其互补链,经退火连接形成sgRNA-sg1和sgRNA-sg2双链后,分别克隆至带有BbsⅠ和BsaⅠ黏性末端的pX461-U6质粒。构建好的重组质粒pX461-U6-sg1+sg2经测序鉴定后,以电转染的方式转入绵羊成纤维细胞,72 h后收集细胞进行检测分析。经T7E1酶切检测分析表明,成功获得1对具有靶向效果的sgRNA,PCR扩增的FGF5基因片段经TA克隆后进行测序鉴定,结果sgRNA-sg1+sg2在靶位点的打靶效率为100%;缺失的核苷酸数从10到64个不等;基于预测的3D模型和RT-PCR结果显示,FGF5基因的突变将会影响FGF5蛋白与其受体的结合,导致FGF5蛋白失去其生物学功能。本研究构建了可以在同一载体中同时表达2条sgRNA和Cas9n以及绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,瞬时转染至绵羊成纤维细胞后,成功获得了高效靶向绵羊FGF5基因的sgRNA位点,为精确和高效的靶向基因工程提供了科学依据。

摘要：目的:构建N-myc下游调节基因1(NDRG1)的shRNA干扰载体和过表达载体,转染人脑微血管内皮细胞(hCMECs)后验证干扰和过表达效果并获得稳定过表达NDRG1的细胞。方法:将pGPU6-GFP质粒采用BamHⅠ和BbsⅠ双酶切后,分别与设计的8条shRNA连接构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体,经测序鉴定后采用Lipofectamine 2000转染hCMECs,采用荧光显微镜观察载体转染效率,将PCR扩增的NDRG1编码区序列与pMD19-T连接,经测序正确后将重组质粒与pcDNA3.1空质粒采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切,连接后构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体,采用Lipofectamine 2000将测序正确的过表达载体转染hCMECs,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测干扰和过表达的hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平,Western blotting法检测hCMECs中NDRG1蛋白表达水平,采用新霉素筛选出阳性克隆hCMECs。结果:pGPU6-GFP载体经双酶切后,电泳结果显示完全线性化,测序结果显示shRNA均成功连接至pGPU6-GFP载体;荧光显微镜观察载体转染效率约为70%;RT-qPCR法检测,有3个shRNA干扰载体的干扰效果良好,转染后hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平分别约为对照组的26%、21%和13%;Western blotting法检测到对应的特异性蛋白条带,重组质粒pcDNA3.1-NDRG1经双酶切后,电泳结果可见大小为1185和5428 bp的2条DNA条带,测序结果显示NDRG1基因成功插入,成功制备阳性克隆hCMECs。RT-qPCR法检测,阳性克隆hCMEC中NDRG1 mRNA表达水平较对照组升高,约为对照组的25.96倍;Western blotting法检测,hCMEC中NDRG1蛋白表达水平较对照组升高。结论:成功构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体并验证干扰效果;成功构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体和稳定过表达NDRG1的hCMECs。

摘要：肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)可负调控骨骼肌的发育。本研究利用胞嘧啶碱基编辑器(cytidine base editor,CBE)在哈萨克羊MSTN基因编码区提前引入终止密码子,以期达到敲除MSTN基因的目的。共设计2条靶向哈萨克羊MSTN基因不同外显子的sgRNAs,分别连接至pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin质粒,并与pCMV-AncBE4 max-P2A-GFP质粒共转染哈萨克羊胎儿成纤维细胞,经CruiserTM酶酶切检测、Sanger测序和TA克隆分析。结果显示,成功筛选出可以在哈萨克羊MSTN基因外显子提前引入终止密码子的2条sgRNAs,其中STOPsg-1靶位点编辑效率为26.7%,STOPsg-2靶位点的编辑效率为6.7%。本研究成功运用CBE(AncBE4 max)技术在哈萨克羊胎儿成纤维细胞MSTN基因编码区实现定点编辑,为培育精确编辑MSTN基因的哈萨克羊奠定基础。

摘要：目的克隆细粒棘球绦虫发育相关基因Tetraspain 2-TSP2(TSP2),并对其进行生物学分析。方法通过在线检索WormBas ParaSite网站中Eg细粒棘球绦虫基因组数据库,获得TSP1的cDNA序列并设计特异性引物。提取细粒棘球绦虫原头蚴总RNA,以此模板,RT-PCR扩增TSP2基因,将PCR产物克隆到pMD19-T载体后进行测序,并进行生物信息学分析。通过SYBR Green I qRT-PCR方法分析TSP2基因在原头蚴、包囊壁以及成虫中mRNA的相对表达量。结果克隆的TSP2基因序列与WormBas ParaSite中已登录的细粒棘球绦虫跨膜蛋白EGR05083.1同源性为100%。TSP2基因cDNA全长621个核苷酸,编码206个氨基酸的TSP2蛋白,理论等电点为7.33,不稳定指数为47.50,为不稳定蛋白。脂肪系数为109.71,亲水性疏水性平均值为0.987,为疏水性可溶性蛋白。TSP2编码的蛋白含有4个跨膜区,4个优势B抗原表位,属于跨膜蛋白家族,该蛋白具有3个开放阅读框。qRT-PCR显示,TSP2基因在细粒棘球绦虫原头蚴、包囊壁及成虫中均有转录,转录水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论细粒棘球绦虫TSP2基因其编码蛋白含有优势B抗原表位,为包虫病重组免疫诊断抗原和亚单位疫苗的研发奠定了基础。