摘要：目的构建大鼠的热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)RNA干扰慢病毒载体。方法设计并合成3对互补针对大鼠HSP27 mRNA的oligoDNA片段。磷酸化和退火后,分别克隆入pSUPER-basic质粒载体,获重组的pSU-PER-HSP27-oligoDNA。将其中表达shRNA的结构酶切插入慢病毒转移质粒pNL-IRES2-EGFP,产生pNL-HSP27-IRES2-EGFP,在293T细胞中与VSVG、pHelper包装产生慢病毒。48 h后收集上清液,离心过滤后进行病毒滴度测定。用构建正确的慢病毒质粒载体感染血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells,VSMCs),检测干扰效果。结果酶切和测序两种方法结果证明3种质粒载体的插入序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为3.12×109fu.L-1。重组慢病毒质粒pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1的RNA干扰效率最高,为0.771。结论成功构建靶向大鼠HSP27基因RNAi慢病毒载体。为进一步研究HSP27功能和用慢病毒进行基因治疗奠定基础。

摘要：背景:脂联素已经成为缺血性疾病基因治疗的新靶点,而成功进行脂联素基因治疗的关键是脂联素基因的克隆。基因克隆主要有定向克隆法和T-A克隆法,定向克隆法操作较复杂;而T-A克隆法操作简便,成功率高。目的:应用T-A克隆法克隆人脂联素基因编码区,对其进行测序验证,并与GenBank比对。设计、时间及地点:基因水平的验证实验,于2006-06/2008-12在福建医科大学附属第一医院高血压研究所及福建中医学院中西医结合研究院完成。材料:脂肪组织取自福建医科大学第一附属医院外科患者术中切除的大网膜脂肪垫,液氮中冻存。Trizol为Invitrogen公司产品;M-MLV,Ge lExtract Kit为PROMEGA公司产品;Taq酶为TIANGEN公司产品;限制性内切酶BamHⅠ,SalⅠ,pMD18-T载体为TAKARA公司产品。方法:从人大网膜脂肪组织提取总RNA,经反转录-聚合酶链反应扩增出人脂联素编码区基因,再将人脂联素基因编码区克隆入载体pMD18-T中,通过限制性内切酶酶切鉴定后,对其进行测序验证,并与GenBank比对。主要观察指标:人脂联素克隆质粒酶切鉴定结果,人脂联素基因克隆序列与GenBank比对结果。结果:扩增得到人脂联素基因编码区,获得人脂联素的正向和反向克隆,与GenBank中人脂联素基因编码区序列比对均为完全一致。结论:成功地克隆出人脂联素基因编码区。

摘要：目的研究纤维连接蛋白激活paxillin后对人胃癌细胞侵袭力的影响,探讨抑制paxillin影响胃癌细胞侵袭力的机制。方法以递增浓度的纤维连接蛋白刺激人胃癌细胞株AGS,以免疫沉淀和蛋白质印迹法检测胃癌细胞内paxillin第118位酪氨酸(tyr-118)磷酸化的变化,同时以改良Boy-den小室法检测细胞侵袭力变化。设计合成paxillin siRNA并进行效果比较,观察siRNA抑制纤维连接蛋白促胃癌细胞内paxillin tyr-118磷酸化及细胞侵袭力的改变。结果纤维连接蛋白能促进AGS细胞paxillin tyr-118磷酸化的增强和胃癌细胞侵袭力(P<0.05),并在一定范围内具有剂量依赖性。siRNA干预后,胃癌细胞内paxillin tyr-118磷酸化及细胞侵袭力均有显著降低(P<0.05)。结论纤维连接蛋白可有效增强胃癌细胞的侵袭力,paxillin tyr-118磷酸化在此过程中起关键作用,使用paxillin siRNA可以抑制纤维连接蛋白促人胃癌细胞侵袭的作用。

摘要：目的建立4个β-地中海贫血基因罕见突变位点反向杂交膜条的基因诊断方法,以用于临床该疾病罕见样本的检测。方法设计并合成8条探针用于检测在中国人中发现的4个β-地中海贫血基因罕见突变位点,将探针点至醋酸纤维膜上,制成反向杂交膜条;通过检测4种罕见临床样本和30份临床阴性标本,对其临床检测效果进行评价。结果共制备了含8条寡核苷酸探针的反向杂交膜条,临床验证结果表明,均能检测出这4种罕见的基因突变位点,而阴性标本未检测出。结论研制的针对4个β-地中海贫血基因罕见突变位点反向杂交膜条敏感度高,特异性好,能准确检测4个β-地中海贫血基因罕见突变的标本,可临床推广应用。