摘要：目的筛选多胺代谢关键酶精胺氧化酶小分子抑制剂,并评价其对人肺癌A549细胞的精胺氧化酶活性抑制效应、抗肿瘤作用及分子机制。方法以精胺和精胺氧化酶复合物结构为基础,用计算机辅助药物设计技术,在化学数据库中虚拟筛选获得候选的小分子抑制剂。以A549细胞为肿瘤细胞模型,利用化学发光法、HPLC法分析小分子抑制剂对精胺氧化酶活性抑制及多胺含量的影响;采用MTT法、流式细胞术检测小分子抑制剂对细胞增值、细胞周期、诱导细胞凋亡的影响;在倒置荧光显微镜、透射电子显微镜下观察小分子抑制剂诱导细胞自噬小体的形成;Western blot法分析小分子抑制剂对细胞周期蛋白(Cyclin B1、p21、Cyclin D)、凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、细胞色素C)和自噬相关蛋白(LC3、P62)表达的影响。结果筛选出有效抑制精胺氧化酶活性的新型小分子抑制剂SI-1338,对精胺氧化酶的半数抑制浓度为880μmol·L^(-1)。SI-1338可有效抑制A549细胞中精胺氧化酶活性,干扰多胺代谢,减少总多胺的含量;抑制A549细胞的增殖,周期蛋白Cyclin B1、p21、Cyclin D表达增加,细胞被阻滞在G_(0)/G_(1)期;A549细胞中Bax的表达增加,Bcl-2的表达减少,细胞色素C的释放增多,凋亡细胞的数量增加;LC3-Ⅱ片段增多,P62蛋白的表达量明显减少,诱导A549细胞中自噬小体形成增加。结论筛选获得新的小分子抑制剂SI-1338。该抑制剂对A549细胞具有高效抗肿瘤效应,其分子机制可能与抑制精胺氧化酶活性、干扰多胺代谢、诱导凋亡和自噬发生相关,有望作为以多胺代谢为靶点的抗肿瘤药物先导化合物。

摘要：以(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸和氯代吡啶为起始原料,设计并合成了系列N-吡啶基-2-(4-芳氧苯氧基)丙酰胺化合物,其结构经1HNMR、LC-MS、13CNMR、IR和元素分析证实,对化合物立体构型与反应条件的关系进行了研究。采用MTT法测定了其对A549和Hela细胞系的活性,结果表明,所合成化合物具有不同程度的抗肿瘤活性,其中N-(3-硝基吡啶-2-基)-2-[4-[(6-氯喹喔啉-2-基)氧基]苯氧基]丙酰胺(Ⅳf)(IC50=0.007 mmol/L)比顺铂(IC50=0.026 mmol/L)抗肿瘤活性高。

摘要：目的:探讨在人宫颈癌Caski细胞中抑制多胺调节因子-1(polyamine-modulated factor,PMF-1)表达对糖皮质激素类药物地塞米松(dexamethasone,DEX)抗肿瘤作用的影响。方法:设计合成靶向人PMF-1基因的si RNA,Western blotting法鉴定其对Caski细胞PMF-1中表达的影响。用DEX处理PMF-1表达抑制的Caski细胞和对照细胞,然后分析PMF-1表达下调是否影响瘤细胞对DEX的敏感性。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,Western blotting法测定糖皮质激素受体(glucocorticoids receptor,GR)的表达水平,高效液相色谱法分析细胞内的多胺含量。结果:用靶向PMF-1基因的siRNA瞬时转染Caski细胞能显著性下调细胞中PMF-1蛋白的表达水平。与对照细胞相比,用DEX处理PMF-1表达下调的Caski细胞能更有效地抑制细胞增殖(P<0.01),上调细胞内GR表达水平(P<0.01),并显著抑制细胞分裂导致G2周期阻滞(P<0.01),同时能显著性地降低细胞内的多胺水平(P<0.01)。结论:抑制PMF-1表达可增强DEX对人宫颈癌细胞的抗肿瘤活性,其机制可能与降低细胞内多胺水平和增强细胞周期阻滞相关。

摘要：目的构建靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,并探讨CKS2敲除对卵巢癌细胞A2780增殖的影响。方法根据siRNA原理设计两对靶向CKS2的shRNA序列(shRNA1、shRNA2)及阴性对照NC shRNA,并克隆到慢病毒表达载体PLKO.1/puro中;将上述质粒转染到293T细胞并包装出慢病毒,用慢病毒感染卵巢癌细胞A2780,实时定量PCR及Western blot检测CKS2表达;MTT法检测A2780细胞增殖;Western blot检测PARP-1的剪切;流式细胞术检测凋亡。结果成功构建CKS2 shRNA慢病毒表达载体能明显降低A2780细胞中CKS2 mRNA及蛋白表达(P<0.05);能显著抑制A2780靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,并包装出慢病毒;感染A2780细胞后,细胞增殖受抑(P<0.05);能诱导PARP-1蛋白的剪切及凋亡(P<0.05)。结论成功构建靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,能显著抑制A2780细胞增殖。

摘要：目的:建立稳定表达可诱导型polo样激酶1(polo-like kinase 1,PLK1)小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)的乳腺癌MDA-MB-231细胞系并研究PLK1敲低对MDA-MB-231细胞增殖、细胞周期的影响并探讨其可能的机制。方法:根据si RNA的原理设计2对靶向PLK1的shRNA序列,构建慢病毒表达质粒(PLK1 shRNA重组质粒);先用p LV-t TR/KRAB-Red空载体制备慢病毒并感染MDA-MB-231细胞;在此基础上再用PLK1 shRNA重组质粒制备慢病毒并感染上述MDA-MB-231细胞;对上述2次慢病毒感染的MDA-MB-231细胞用强力霉素(doxycycline,DOX)处理96 h后,用q RT-PCR及Western blot检测PLK1m RNA及蛋白的表达;用MTT法检测细胞增殖;用流式细胞术及碘化吡啶(PI)染色检测细胞周期。结果:成功构建靶向PLK1的shRNA慢病毒表达质粒,包装出慢病毒并感染MDA-MB-231细胞;成功建立稳定表达可诱导型PLK1 shRNA的MDA-MB-231细胞系,通过DOX诱导,可明显抑制该细胞系中PLK1在m RNA及蛋白水平的表达(P<0.01);PLK1敲低可明显抑制MDA-MB-231细胞的增殖(P<0.05);流式细胞术检测发现PLK1敲低可阻滞MDA-MB-231细胞于G2/M期(P<0.05)。结论:DOX诱导的PLK1敲低可明显抑制MDA-MB-231细胞增殖并阻滞细胞于G2/M期;经PLK1介导的肿瘤生物学行为变化,其机制可能涉及ERK1/2/Fra1/ZEB1信号通路。

摘要：目的原核表达和纯化腺相关病毒(AAV)衣壳保守区抗原肽,制备抗AAV衣壳保守区的兔多克隆抗体。方法设计并合成编码AAV衣壳蛋白保守区的DNA,将序列克隆到载体pET30a,获得质粒pET30a-AAV-CR,原核表达并纯化保守区多价抗原肽,考马斯蓝染色法及Western blot法对AAV保守区多价抗原肽进行鉴定。将日本大耳朵白兔分为实验组与对照组(1只/组),实验组注射AAV保守区蛋白制备多克隆抗体,对照组注射PBS,ELISA检测抗体效价,Western blot及细胞免疫荧光法检测抗体应用效果。结果成功构建了表达AAV衣壳保守区抗原肽的质粒pET30a-AAV-CR,表达纯化得到相对分子质量为17000的蛋白质;纯化后的蛋白可在兔体内诱导产生针对AAV衣壳保守区的抗体,且该抗体能广泛性识别AAV1-AAV10衣壳蛋白序列。结论诱导出AAV衣壳保守区蛋白并成功获得了抗AAV衣壳保守区的多克隆抗体,为后续载体开发以及生物学功能研究奠定了基础。