摘要：牛A群轮状病毒(BRVA)、牛冠状病毒(BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛诺瓦病毒(BNoV)和牛纽布病毒(BNeV)是引起犊牛腹泻的常见病毒,且临床上多存在混合感染的情况。本试验的目的是建立可以同时检测上述5种病毒的多重PCR方法。通过设计引物,优化反应体系和条件,成功建立了可同时检测BRVA、BCoV、BVDV、BNoV和BNeV的多重PCR方法。该方法只特异性检出目标病毒,而对牛星状病毒、牛嵴病毒、牛细小病毒、产肠毒素大肠杆菌、沙门菌和空肠弯曲杆菌等腹泻病原均无扩增,具有良好的特异性和稳定性。对BRVA、BCoV、BVDV、BNoV、BNeV的最低检测下限分别为1.63×10^(5)、2.0×10^(6)、1.9×10^(5)、1.96×10^(5)和2.0×10^(5)copies·μL^(-1)。比较试验表明,该多重RT-PCR方法与检测单一病毒的RT-PCR方法的符合率为100%。利用该方法对2019—2020年采集自川西北草原的220份牦牛腹泻样本的检测结果表明,BRV的检出率为40.5%、BNoV的检出率为5.9%、BNeV的检出率为4.5%,而BVDV和BCoV无检出。本研究建立的多重RT-PCR方法可同时检测犊牛腹泻粪便样品中的5种常见腹泻病毒,为牛腹泻的快速诊断提供了技术支持。

摘要：为研究羊口疮病毒(ORFV)新型亚单位疫苗,设计了ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白,命名为HBBH并经原核表达和鉴定。以不同剂量HBBH不加或加不同佐剂,经滴鼻或颈部皮下注射免疫BALB/c小鼠,其中滴鼻共4组(HBBH 10μg、20μg、30μg和20μg+LTB),注射组(HBBH 20μg+201佐剂)。同时设ORFV组织灭活抗原+201佐剂注射免疫对照和空白对照,每组共免疫3次,每次间隔7 d。HBBH间接ELISA检测一免、二免、三免后7 d以及三免后14 d血清中ORFV IgG、IgA和三免后14 d肺灌洗液sIgA的抗体水平,取不同水平的IgG ELISA阳性血清检测细胞中和抗体效价。结果显示,表达并鉴定了具有良好反应原性的包含ORFV B2L蛋白优势抗原表位的截短重组蛋白HBBH。免疫小鼠试验结果表明,不同剂量HBBH通过滴鼻或颈部皮下注射均可刺激小鼠产生ORFV特异性IgG抗体,20μg HBBH+201佐剂注射免疫能最大刺激小鼠血清IgG抗体的产生。实验小鼠三免后14 d肺灌洗液特异性sIgA仅在HBBH滴鼻免疫剂量≥20μg的三个组中检测到,其中30μg HBBH组刺激小鼠产生了最高水平的sIgA。在同为20μg HBBH滴鼻免疫时,添加LTB佐剂刺激小鼠产生了更高水平的sIgA。表明一定剂量的HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫可更好地刺激小鼠产生sIgA。HBBH间接ELISAIgG阳性血清的细胞中和抗体效价可高达1:128,且能中和4株ORFV分离株。结果表明,20μgHBBH+201佐剂注射免疫3次和20μg HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫3次均能刺激BALB/c小鼠产生高水平的抗ORFV血清中和抗体IgG和黏膜抗体sIgA。本研究为ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白作为亚单位疫苗提供了数据支持。