摘要：为建立快速同步检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒与牛冠状病毒的多重RT-PCR检测方法并应用于临床检测。根据GenBank中三种病毒参考毒株的基因序列,设计3对特异性引物。利用构建的三种病毒的标准质粒进行三种病毒的三重RT-PCR方法,进行特异性、敏感性和重复性检验,并进行临床样品检测。特异性结果显示,建立的牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的三重RT-PCR方法可特异性扩增出阳性标准质粒的基因片段,对牛源沙门氏菌、大肠杆菌、牛巴氏杆菌、牛支原体无扩增;敏感性结果显示,对牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒质粒核酸最低检测浓度分别为250、 250和25ng/mL。重复性结果显示,能扩增出一致的目的基因条带。临床样品结果显示,三重RT-PCR方法和单一RT-PCR符合率100%。可见,建立牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的三重RT-PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,可进行临床检测。

摘要：为建立快速、准确的检测牛呼吸道主要病原菌牛支原体(Mycoplasma bovis)、牛多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)及牛结核分枝杆菌(***)的方法,对牛支原体oppD基因序列、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因序列、牛结核分枝杆菌IS6110基因序列分别设计特异性引物,对单一PCR检测方法进行优化后建立三重PCR检测方法。结果表明:三重PCR的最佳扩增条件为94℃预变性10min;94℃1min,60℃50s,72℃1min,循环30次;72℃延伸10min。建立的三重PCR方法能对同一样本中的3种病原菌进行扩增,特异性强。牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌的最低检测DNA浓度分别为5.306×10^-3ng/μL、3.075×10^-2ng/μL和1.605×10^-4ng/μL。建立的三重PCR方法临床检测牛支原体肺炎鼻拭子、牛结核分枝杆菌、结核菌素与单一PCR检测方法的阳性符合率为100%。三重PCR检测方法可用于牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌的单一和混合感染鉴别诊断,具有快速、准确、简便的特点。