摘要：水稻P450基因家族成员CYP81A6参与稻瘟病抗性反应,为了深入研究该基因的功能,本研究利用3次克隆的策略构建了该基因的RNAi载体。首先设计带有酶切位点的基因特异性引物,以c DNA为模板扩增3'非翻译区的特异片断,将目的产物连接到T载体上,经菌落PCR和酶切鉴定后进行测序。测序结果表示,目的片断已正确克隆到T载体上。然后利用双酶切通过2次亚克隆将目的片断以反向重复克隆到RNAi载体ds1301,通过分子检测表明,CYP81A6的RNAi载体构建成功,有助于后续的基因功能和作用机理的研究。

摘要：本研究建立了转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法。根据A2704-12转化体外源插入片段5'端与大豆基因组连接区序列设计特异性引物,以大豆内源基因Lectin为内标,从A2704-12转化体中特异性扩增出239bp大小的特异性目的片段。同时对该方法特异性和灵敏度进行测试,结果显示:该方法能检测出A2704-12转化体中的特异性DNA片段;其检测灵敏度可达到0.05%。本文建立的方法特异性强,灵敏度高,可为今后转基因耐除草剂大豆A2704-12的市场监管提供技术支撑。

摘要：OSCA(Hyperosmdality-gate calcium-permeable channels)是钙通透性阳离子通道蛋白,通过参与感知细胞外渗透势的变化,诱导Ca^(2+)浓度增加,调节渗透势,在高渗胁迫感应中发挥重要的作用。本研究从毛果杨基因组中鉴定得到16条OSCA基因序列并根据其在染色体上的分布将它们重新命名。基于系统发育树分析,将PtOSCAs基因分为4组,每一组中的OSCA基因都具有相似的基因结构。从杨树OSCA家族基因间鉴定到2个重复事件,分别为涉及3个基因的一个串联重复事件和涉及2个基因的一个片段重复事件,并且每一对基因的Ka/Ks值均在1以下,由此可见,进化中杨树OSCA家族基因存在纯化作用。通过分析PtOSCAs基因在低浓度以及高浓度盐胁迫下的表达情况,发现存在以下三类:第Ⅰ类,在低浓度及高浓度盐胁迫下表达量均出现上升;第Ⅱ类,在低浓度和高浓度盐胁迫下表达量均下降;第Ⅲ,在低浓度盐胁迫下表达量呈上升趋势,但是在高浓度盐胁迫下表达量呈下降趋势。此研究为PtOSCAs基因的功能分析和杨树的遗传改良提供了参考。

摘要：棉花黄萎病是制约棉花产业健康发展的一种重要病害,在生产上未发现有效的根治办法,使用现代基因工程技术,从基因库中挖掘抗黄萎病相关基因,为棉花抗黄萎病育种工作的提供理论基础。本研究根据在GenBank中检索到抗黄萎病基因SDAHP(GU479467,1,3-脱氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶),从陆地棉基因组数据库中检索到3个同源基因(NM_016893351.1,XM_016849738.1和XM_0168151150.1),根据3个同源基因核苷酸序列设计引物,以陆地棉cDNA为模板进行克隆,获得3个目的基因,依次命名为GhDAHP-1、GhDAHP-2和GhDAHP-3。利用ProtParam和Prot Scale等在线软件对目的基因进行生物信息学分析;RT-PCR分析黄萎病菌诱导后目的基因在陆地棉叶片中的表达量。结果表明:GhDAHP-1序列全长1983 bp,氨基酸总数为539,分子质量约59.45378 kD,理论等电点pI为8.7;GhDAHP-2序列全长1832 bp,氨基酸总数516,分子质量约57.02998 kD,理论等电点pI为7.68;GhDAHP-3序列全长1652 bp,氨基酸总数517,分子质量约56.95491 kD,理论等电点pI为8.52。系统进化树分析,GhDAHP与雷蒙德氏棉(Gossypium raimindii)、木本棉(Gossypium arboreum)的亲缘关系最近。棉花叶片在黄萎病菌的处理下,GhDAHP基因表达量呈现先升高后降低的趋势,推测受到黄萎病诱导后,GhDAHP基因可能参与了黄萎病菌侵染的防卫过程。

摘要：为明确拟南芥(Arabidopsis thaliana)光敏色素B激活标签的抑制蛋白1(phy B activation-tagged suppressor1,BAS1)基因对烟草(Nicotiana tabacum)中烟碱、降烟碱和N-亚硝基降烟碱合成的影响,通过构建含有不同启动子的植物表达载体p SH-p LXM5-BAS1和p SH-35S-BAS1遗传转化烟草。在8~10叶期分别取转基因和野生型烟草植株相同部位的叶片,采用LC-MS方法对样品中烟碱、降烟碱、亚硝基降烟碱含量进行测定,结果表明转基因烟草烟碱含量和降烟碱含量与野生型相比均明显提高。转p LXM5-BAS1基因和转35S-BAS1基因植株烟碱含量分别是野生型植株2.9倍和2.95倍;同时测得降烟碱含量分别为野生型的3.35倍和3.76倍;在转基因和野生型烟草中均未检测到亚硝基降烟碱。表明超量表达At BAS1对烟草的烟碱和降烟碱合成存在显著影响。据NCBI数据库中报道的烟碱合成相关基因PMT和QPT,降烟碱合成相关基因CYP82E4v1、CYP82E5v2、CYP82E10的序列,设计各基因的Real-time PCR引物,并以烟草β-Actin基因作为内参,Real-Time PCR结果表明烟碱和降烟碱合成相关基因表达均出现不同程度的上调。综上可知,在烟草中超量表达At BAS1基因,促使烟碱和降烟碱合成相关基因表达的上调,直接导致了烟草中烟碱含量和降烟碱含量的大幅提高。本研究为后续深入挖掘影响烟碱及降烟碱生成及转化的新基因并最终构建完整的烟碱代谢网络提供了借鉴,也为研究烟碱向降烟碱转化过程中信号因子和信号传递提供了一个新途径。

摘要：为了寻找与大豆再生直接相关的基因,提高大豆转化率,解决大豆再生和转化困难的问题,以再生较好的东农50、再生较差绥农14两个大豆品种为材料,设计不同2,4-D浓度处理及不同取材时间,测定与大豆再生相关的IAA、SOD、PAL以及再生率指标。结果表明:东农50在2,4-D浓度为8 mg/L、12 h处理下IAA浓度最大,比对照增加了76.9%,在2,4-D浓度为4 mg/L、4 h处理下SOD酶活性增幅最高,比对照增加了50.9%,在2,4-D浓度为4 m/L、8 h处理下PAL酶活性最高,比对照增加了76.4%;绥农14在2,4-D浓度为8 mg/L、2 h处理下IAA浓度最大,比对照增加97.1%,在2,4-D浓度为4 mg/L、12 h处理下SOD酶活性最高,比对照增加23.8%,在2,4-D浓度为2 mg/L、4 h处理下PAL酶活性最高,比对照增加53.9%。东农50和绥农14均在2,4-D浓度为4 mg/L时再生率最高,分别为87.6%和79.5%。依照该实验结果进行取材,应用转录组测序技术挖掘与大豆再生直接相关的基因,解释再生作用机理,解决大豆再生和转化受基因型限制的难题,为大豆基因功能研究及转化率的提高提供了理论和技术支持。

摘要：对梅山猪胎儿成纤维细胞的分离培养及性别快速鉴定进行研究,为开展猪体细胞克隆、诱导多能干细胞获取及转基因等提供素材。通过取组织块培养法和胰蛋白酶消化培养法均成功得到梅山猪的胎儿(胎龄35 d)成纤维细胞,取其中7个梅山猪(msz4、msz5、msz6、msz9、msz11、msz14和msz15)胎儿的原代成纤维细胞,在传代培养至第5代时收集贴壁生长的细胞,提取基因组DNA。再利用根据SRY及ZFY/X设计的共2对引物进行PCR反应,扩增后进行琼脂糖凝胶电泳,出现166 bp和445/447 bp两条带的为雄性,只有445/447 bp一条带的为雌性。结果表明梅山猪的细胞系msz6、msz9和msz14为雌性细胞系,而msz4、msz5、msz11及msz15为雄性细胞系。试验结果证明了该方法可应用于鉴定不同培养方法获得猪成纤维细胞的性别,可为试验后期的转基因细胞制备提供性别依据。

摘要：本研究利用Genefishing技术,从经过白粉病菌E09诱导处理12 h的高抗白粉病菌小偃麦(小麦-中间偃麦草异附加系)种质SN6306的c DNA中获得上调表达差异片段,经克隆测序,获得一个375 bp的序列。在NCBI数据库和小麦全长数据库Tri FLDB中进行相似性比对,预测其为TGA4转录因子的一段序列。设计序列的特异引物,经PCR扩增,从SN6306中克隆到小麦Ta TGA4基因的c DNA全长序列,并对该基因及其所编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析。结果表明,Ta TGA4基因序列的开放阅读框长度为1 221 bp,编码含406个氨基酸残基的蛋白。BLASTP相似性比对分析显示,Ta TGA4含有b_ZIP1超家族与DOG1超家族两个保守结构域,且该蛋白与小麦的近缘物种节节麦中的同源蛋白一致性达到92%,与乌拉尔图小麦中的同源蛋白一致性达到90%。从多序列联配及系统进化树分析中可以推断出Ta TGA4属于TGA4转录因子类。本研究可为Ta TGA4基因在小麦抗白粉病中的功能研究打下基础。

摘要：根据本实验室已建立的杜仲转录组数据库提供的序列信息设计引物,以杜仲含胶组织叶和皮为材料提取总m RNA,采用RACE技术克隆了5'端700 bp和3'端600 bp c DNA片段,连接至p GEM-T载体,经测序拼接后获得全长1 075 bp的杜仲橡胶延长因子基因(Eucommia ulmoides rubber elongation factor 1,Eu REF 1)c DNA序列,其中开放阅读框678 bp,共编码225个氨基酸残基。在NCBI中blastp比对,Eu REF 1与葡萄、蓖麻REF序列同源性分别为42%和41%;预测的蛋白质Eu REF 1氨基酸序列经blastp比对,显示该预测蛋白质序列属于REF超家族。本研究首次克隆杜仲的橡胶延长因子基因c DNA序列,构建了表达载体p SH-35S-Eu REF 1,通过农杆菌介导法对烟草长脖黄进行遗传转化,经PCR检测和GUS组织染色,获得转基因烟草43株,移栽生长四个月的转基因烟草在表型上与野生型在叶片长宽比上有明显差异。

摘要：类钙调蛋白(CaM-likeprotein,CML)在植物抵抗逆境中发挥了重要的作用,因此研究CML基因是植物抗逆分子育种的一个重要分子基础。本实验室在前期工作中筛选得到1个片段大小为264 bp的大豆CML基因,对该基因序列设计特异性引物,利用PCR技术对该基因进行扩增,并获得大小为264 bp的片段,利用无缝克隆技术连接到pMD18T载体上,获得克隆载体。通过对该基因的核苷酸序列分析,在NCBI上发现该基因序列与大豆Calcium-binding protein(CML38-like)基因序列相似度为98.53%。目前对CML38-like基因的功能还未见报道,本研究根据克隆测序得到的基因序列构建系统进化树并分析,随后对该基因的蛋白质二级结构和蛋白质三级结构进行预测,发现该基因可能对大豆抗旱有着一定的影响。最后通过克隆载体构建CML38-like基因的过表达载体以及RNA干扰表达载体。本研究为鉴定大豆CML38-like基因的功能和了解该基因对大豆的非生物胁迫反应的影响提供了理论依据。