摘要：应用CRISPR-Cas9系统对人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)进行基因编辑,为疾病模型的建立、致病机制研究、药物筛选及基因校正治疗疾病提供了更广阔的平台。相对于CRISPR-Cas9介导的基因敲除,应用该系统介导的同源重组实现基因点突变或突变校正效率要低、且难度偏大。为了实现对MYO7A杂合点突变(c.4118C>T)的人i PSCs的点突变校正,本文构建了表达maxGFP的pX330质粒。针对需校正的突变位点,设计5组识别序列并连接到maxGFP-pX330中构建靶向质粒。将5组打靶质粒分别转染HEK 293FT细胞48 h,细胞表达GFP;测序结果显示,MYO7A基因相应位点出现杂峰,表明打靶质粒具有打断活性。将同源模版单链寡核苷酸链(single-stranded DNA oligonucleotides,ss ODN)与打靶质粒共同电转入人i PSCs后48 h,经流式分选出(5. 8±2. 2)%的细胞表达GFP。分选后细胞行单克隆扩增并测序。结果显示,打靶质粒1和ss ODN组合对点突变校正未成功;打靶质粒2、3、4、5与ss ODN组合均获得了校正后的细胞株。本研究表明,打断位点是影响同源重组校正效率的关键因素。当应用CRISPR/Cas9(或其它核酸酶)介导的同源重组进行基因编辑操作时,可以同时选择多个打靶位点造成基因组不同位置上的双链打断(double-stranded break,DSB)位点,以获得目的单克隆细胞株。本研究为应用CRISPR-Cas9系统对人诱导多能干细胞进行基因编辑提供了有力参考。

摘要：腹膜转移是结直肠癌治疗领域的热点和难点,NCCN指南和PSOGI推荐肿瘤细胞减灭术(CRS)加腹腔热灌注化疗(HIPEC)治疗轻中度结直肠癌腹膜转移。在CRS+HIPEC治疗结直肠癌腹膜转移领域,腹膜转移高风险患者行二次探查+HIPEC是否有生存获益,以及HIPEC在该整合治疗体系中的价值,是两个争议已久的重要问题。针对上述问题,法国学者开展了两项随机对照研究:PROPHYLOCHIP研究和PRODIGE 7研究。(1)PROPHYLOCHIP研究发现,腹膜转移高风险患者初次手术后,密切观察组与二次探查+HIPEC组的DFS、OS比较差异无统计学意义,认为若初次手术理想、肿瘤细胞减灭完全,则无必要行二次探查+HIPEC;(2)PRODIGE 7研究发现,结直肠癌腹膜转移患者行完全CRS,联合或不联合HIPEC,其OS(41.7个月比41.2个月,P=0.99)和无复发生存(RFS)(13.1个月比11.1个月,P=0.43)比较差异均无统计学意义,认为对于此类患者行HIPEC是非必要的。然而,由于该研究设计和实施过程中的系列问题,其结论引起了巨大争议,未得到广泛认可。经过详细分析和深入探讨,我们认为,尚不能根据PRODIGE 7研究否认HIPEC的价值。CRS+HIPEC为核心的整合技术体系是"实体瘤治疗是以手术为主的整合治疗"理念的体现和典范,CRS是基石,完全CRS是改善患者预后的关键,HIPEC是CRS的有效补充。