摘要：目的建立基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)-规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas13a)准确检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)型碳青霉烯酶基因的方法。方法收集2020—2021年北京市垂杨柳医院保存的25株产耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)临床分离株和5株碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌(CSKP),提取菌株总DNA。设计检测KPC DNA特异性RAA引物和检测CRISPR RNA(crRNA),建立基于RAA-CRISPR-Cas13a技术快速准确检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法。通过KPC质粒和临床样本菌株对方法进行评价,同时使用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)方法进行检测,比较2种方法的检出率和一致性。结果本研究建立的RAA-CRISPR-Cas13a方法检测KPC质粒和样本的检测灵敏度均可达到1拷贝/μl,高于qPCR(101拷贝/μl)。RAA-CRISPR-Cas13a检测方法和qPCR方法均从30株临床菌株(包含25株CRKP菌株和5株CSKP菌株)中检出23株携带KPC基因,7株未检出KPC基因,25株CRKP菌株中KPC基因检出率为92%(23/25),2种检测方法阳性符合率为100%(23/23)。结论将RAA扩增技术结合CRISPR-Cas13a技术,建立了一种准确检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法。该方法有助于精准的筛选产KPC型碳青霉烯酶的菌株。

摘要：目的:基于红色打样膏初印模三维扫描,建立一种无牙颌个性化托盘的计算机辅助设计(computer aided design,CAD)和工艺熔融沉积制造(fused deposition modeling,FDM)制作方法,定量评价加工精度。方法:在标准上颌无牙颌石膏模型上制取红色打样膏初印模,用牙颌模型三维扫描仪扫描红色打样膏初印模,得到扫描数据,在Gemomagic 2012软件中用交互绘制曲线、局部填补空洞、局部增厚、整体偏移、整体抽壳等命令,完成提取托盘边界、填倒凹、缓冲、预留终印模三维空间和生成托盘厚度的操作,设计标准形状手柄,得到个性化托盘三维设计数据。将托盘设计数据导入与FDM三维打印设备连接的电脑系统,打印聚乳酸(polylactic acid,PLA)材质的无牙颌个性化印模托盘,用牙颌模型三维扫描仪扫描托盘整体。在Gemomagic 2012软件中,以托盘组织面为共同区域,将个性化托盘CAD数据和个性化托盘三维扫描数据进行配准,利用Imageware 13.0的点云偏差分析功能测量三维设计数据和三维扫描数据之间的偏差。扫描石膏模型得到其表面三维数据,将石膏模型数据对齐于印模数据,同时个性化托盘扫描数据对齐于个性化托盘三维设计数据,利用Imageware 13.0的点云偏差分析功能测量三维扫描数据和石膏模型数据表面的距离。结果:与CAD数据对比,加工完成的上颌个性化托盘内表面整体平均偏差为(0.17±0.20)mm,主承托区平均偏差为(0.19±0.18)mm,副承托区平均偏差为(0.17±0.22)mm,边缘封闭区平均偏差为(0.30±0.29)mm,缓冲区平均偏差为(0.08±0.06)mm;托盘内表面与石膏模型表面平均间隙大小为(1.98±0.40)mm,主承托区平均间隙量为(1.85±0.24)mm,副承托区平均间隙量为(1.86±0.26)mm,边缘封闭区平均间隙量为(1.77±0.36)mm,缓冲区平均间隙量为(2.90±0.26)mm。结论:结合红色打样膏初印模三维扫描、CAD和FDM技术,可成功实现上颌无牙颌个性化托盘的数字化设计和制作。

摘要：目的 评价基于CRISPR-Cas13a技术的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)检测方法的应用价值。方法 收集25例HBV感染患者和5例非HBV感染患者的肝组织标本,提取肝组织的总DNA,依次使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)消化;设计HBV cccDNA的特异性引物,扩增消化后的产物;利用CRISPR/Cas13a技术建立CRISPR-HBV cccDNA检测方法,通过HBV cccDNA质粒和临床样本对该方法进行评价,并利用数字PCR和荧光定量PCR方法进行比较。结果 本研究建立的方法检测HBV cccDNA质粒的灵敏度为1 copies/μL,显著高于数字PCR(10 copies/μL,P<0.01)和荧光定量PCR(10^(3)copies/μL,P<0.01);建立的方法检测HBV cccDNA阳性样本的灵敏度为1 copies/μL,与数字PCR相同,高于荧光定量PCR(10 copies/μL,P<0.01);建立的方法对25例HBV感染的临床肝组织样本的检出阳性率为80%,均高于数字PCR(64%)和荧光定量PCR(48%)。结论 本研究建立的CRISPR-HBV cccDNA检测方法在乙肝患者肝组织标本HBV cccDNA检测中具有较高的灵敏度,为评价乙肝患者的临床治疗效果和监测停药复发等情况提供了有效帮助。

摘要：目的建立基于微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术检测HBV DNA的方法,并实现对乙型肝炎低病毒血症患者HBV DNA的精准检测。方法构建pUC57-HBV质粒作为阳性对照质粒,设计合成HBV DNA ddPCR引物及探针,以梯度稀释的阳性对照质粒为模板进行ddPCR检测,完成标准曲线构建和检出限分析,并进行检测的重复性和特异性分析。收集首都医科大学附属北京佑安医院19例乙型肝炎低病毒血症患者的血浆样本(HBV DNA<10 IU/mL),提取HBV DNA后进行ddPCR检测。结果建立的基于ddPCR技术检测HBV DNA的方法检测下限低至1 copy/μL(阳性质粒稀释法);对3种不同拷贝的阳性对照质粒(1×10^(2)、1×10^(1)、1×10^(0) copies/μL)重复检测的变异系数分别为18.8%、9.9%、9.7%,且具有100%特异性;应用该方法在低于临床检测下限的乙型肝炎低病毒血症患者中,以1 copy/μL为临界值,HBV DNA的阳性检出率为68.42%。结论建立的ddPCR检测低病毒载量HBV DNA检测方法能够高灵敏和高特异地对乙型肝炎低病毒血症患者HBV DNA实现绝对定量。

摘要：目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后,使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)分别进行酶切;根据松弛环状DNA(rcDNA)和cccDNA的结构差异,设计特异性扩增HBV cccDNA的引物,对酶切后的产物进行滚环扩增(RCA)和PCR扩增;并筛选crRNA,建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果利用α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和HBV表面抗原(HBsAg)引物对双重酶切后的产物进行扩增,验证产物中HBV基因组的存在;利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增,验证了产物中只存在HBV cccDNA;利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释,然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测,计算出检测下限为10拷贝/μl。结论本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法,可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测,为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。