摘要：目的:针对目前结核性疾病实验室诊断的局限性,探索一种更为敏感和特异的结核分枝杆菌DNA检测新方法。方法:选取10株江苏地区流行的结核分支杆菌(MTB)菌株,选取临床其他常见菌株及分枝杆菌菌株作为对照组,分别提取DNA作为随机引物的模板。参考国内、外文献设计12条随机引物,并分别对MTB及对照菌株进行单个引物随机扩增,2%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离并切胶纯化,通过TA克隆将纯化片段连接到质粒pEASYTM-T5 Zero并进行测序,通过BLAST-nr比对验证是否为MTB DNA片段。按照所确定的MTB片段序列,在其内部设计、合成一对特异性引物。用此特异性引物扩增对应的随机引物扩增产物,获得MTB特异性条带图谱。并将该方法检测的敏感性和特异性与临床上常用的real-time PCR进行比较。结果:经BLAST-nr比对,随机引物IS986F,S535及IS986R扩增的条带与MTB DNA有高度同源性(均为99%)。随机引物IS986F、S535和IS986R分别联合其特异性引物可以检测稀释105倍、105倍和103倍的MTB DNA,其特异性分别为100%、90%和80%。常规real-time PCR可检测出稀释104倍的MTB DNA。结论:随机引物IS986F联合其特异性引物检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性优于S535、IS986R两组,特异性为100%,且灵敏度优于常规real-time PCR法。

摘要：目的结合随机扩增多态性技术(RAPD)和荧光定量聚合酶链式反应技术(qPCR)的优势,建立快速、准确地检测结核分枝杆菌的新方法。方法根据国内外文献设计随机引物,以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv为模板进行RAPD,产物进行琼脂糖凝胶电泳,选取条带进行割胶纯化测序,在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序上进行同源性检索,结果和结核分枝杆菌匹配率都达到99%。设计特异性内引物和探针,以RAPD产物为模板进行qPCR,并优化反应条件。分别以10倍梯度稀释的一系列浓度的H37Rv和其他阴性对照菌为模板,进行qPCR和RAPD-qPCR,分析其灵敏性和特异性。结果 qPCR能够检测到30pg/μl的结核分枝杆菌,而RAPD-qPCR灵敏性提高到3fg/μl。而且RAPD-qPCR检测30pg/μl至30fg/μl的结核分枝杆菌核酸时,扩增得到的Ct值都较小[(6.58±0.19)^(14.95±0.36)],结果稳定,易于判断。qPCR和RAPD-qPCR检测其他临床常见的细菌均呈现阴性。结论 RAPD-qPCR是一种快速、准确地检测出结核分枝杆菌的新方法。