摘要：为了研究鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)VP1蛋白的优势抗原区,试验根据DHAV-3 VP1基因序列设计4对特异性表达引物,用PCR获得VP1-a^d基因片段,并在p ET-30a(+)/Rosetta(DE3)p LysS系统中进行原核表达;经IPTG诱导重组蛋白获得表达,用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白;同时以DHAV-3病毒为免疫原制备鼠抗DHAV-3多克隆抗体,通过I-ELISA和Westernblot初步鉴定。结果表明:p ET-30a-VP1-a、p ET-30a-VP1-b、p ET-30a-VP1-c和p ET-30a-VP1-d与鼠抗DHAV-3多克隆抗体都发生反应,抗原量相同的情况下VP1-c和VP1-d段显色较VP1-a和VP1-b深,说明这两段反应性相对较强;4种截短蛋白与鸭抗DHAV-3阳性血清进行反应,只有p ET-30a-VP1-c显色。说明VP1-c免疫原性较强,DHAV-3 VP1蛋白的90~175 aa为其优势抗原区。

摘要：拟制备鸭肠炎病毒(DEV)gB抗原优势区的多克隆抗体,初步应用于该病毒的检测。以本实验室克隆的DEVC-KCE株ul27基因序列为参考序列设计特异性引物,通过PCR获得DEV gB优势表位区域基因片段gB-AD(331—570bp),并在pET-32a(+)/Rosetta(DE3)pLysS系统中进行原核表达。经IPTG诱导获得与预期大小相符的重组蛋白质,以Ni-NTA柱亲和层析法纯化重组蛋白质,利用DEV阳性血清检测重组蛋白质的抗原性,并用切胶纯化的重组蛋白质免疫家兔,制备兔抗DEV gB-AD血清。结果显示,重组蛋白质可被DEV阳性血清特异性识别,制备的兔源多克隆抗体I-ELISA效价为1∶10 240,且其具有中和活性;兔源多克隆抗体在还原电泳条件下显示DEV gB的相对分子质量约为66ku,而在非还原电泳条件下DEV gB显示为相对分子质量约120和66ku的两条目的带,通过间接免疫荧光试验和中和试验进一步证实制备的兔源多克隆抗体可特异性识别鸭肠炎病毒感染细胞所合成的gB蛋白。结果表明,所制备的兔抗DEV gB-AD多克隆抗体可作为检测DEV的试剂,为DEV检测及gB的功能研究提供必要的基础数据和材料。

摘要：以本实验室已克隆的鸭肠炎病毒（DEV）C-KCE株ul27基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得编码鸭肠炎病毒gB N端第60～110aa的目的基因片段,大小为150bp。将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a（＋）中,阳性质粒被命名为pET-32a（＋）-gB-1。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为27ku。用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,鸭抗DEV阳性血清经间接ELISA检测证实其具有抗原性,并以此为免疫原免疫家兔制备抗血清,经间接ELISA检测,抗血清效价为1∶25 600。应用间接免疫荧光及Western-blot分析制备的抗血清的反应性,均证实抗血清可特异性识别DEV gB蛋白。分别以重组蛋白和DEV超离病毒为检测抗原进行间接ELISA,检测DEV免疫鸭的抗体消长规律,结果显示两者的抗体变化趋势一致。以上结果表明,制备的抗血清可作为DEV检测的候选试剂,表达的重组蛋白可作为DEV抗体检测的诊断抗原。