摘要：【目的】制备红嘴鸥Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)蛋白多克隆抗体,分析红嘴鸥TLR7蛋白在DF-1细胞中的表达特征,为深入了解红嘴鸥TLR7蛋白功能及作用机制提供材料。【方法】设计引物扩增红嘴鸥TLR 7基因CDS区,并构建其原核表达载体与真核表达载体。将重组原核表达质粒pET32a-TLR7转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞进行重组蛋白体外诱导表达,并对其诱导温度、诱导时间和IPTG浓度进行优化筛选。选用新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测血清抗体价效,利用Western blotting鉴定抗体特异性。将真核表达质粒pcDNA3.1-TLR7转染至DF-1细胞中过表达,利用间接免疫荧光技术检测红嘴鸥TLR7蛋白在转染DF-1细胞后不同时间点的表达特征。【结果】红嘴鸥TLR 7基因CDS区长约1182 bp,双酶切结果显示出2组大小不同的2条片段,分别为5900、1182 bp(原核表达载体)和5428和1182 bp(真核表达载体),测序后表明原核表达载体与真核表达载体构建成功。体外诱导温度为30℃、IPTG终浓度为1.0 mmol/L时培养5 h得到以包涵体形式大量表达的重组蛋白,蛋白大小为63 ku。间接ELISA法检测抗血清效价为1∶256000以上。Western blotting检测结果表明,制备的多克隆抗体具有较好的特异性。间接免疫荧光结果显示,转染DF-1细胞2 h后即可观察到绿色荧光,随着时间增加绿色荧光密度逐渐增加,且绿色荧光大部分聚集在细胞核及周围,少部分散布在细胞质中。【结论】原核表达的红嘴鸥TLR7蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,TLR7蛋白可在DF-1细胞中成功表达。

摘要：为加强副结核分支杆菌(MAP)的检测、监测与防控,建立MAP荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据国内MAP流行菌株特异性插入序列IS900设计1对特异性引物和探针,构建重组阳性质粒用作建立qPCR的模板,优化反应体系和条件,验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法最低检测限为5拷贝/μL;重复试验中批内和批间变异系数均小于4%;与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛支原体、肺炎克雷伯菌和曼氏杆菌等病原检测无交叉反应,能特异性检出MAP。应用建立的qPCR开展了内蒙古自治区6个市的MAP临床样品检测和流行情况分析,结果显示MAP平均阳性率为0.85%(6/704)。结果表明,成功建立了MAP的实时荧光定量PCR检测方法,可用于临床中MAP的监测和调查,为MAP疾病诊断与监控提供了快捷的方法。