摘要：目的构建沉默人Bcl-2拮抗1基因(Bak1)的重组腺病毒,感染人成骨肉瘤细胞MG63并检测其对细胞活性的影响。方法设计特异性针对Bak1的sh RNA序列及无关对照序列scr,分别构建重组腺病毒表达载体,感染人成骨肉瘤细胞MG63,利用q PCR和Western blot检测Bak1基因沉默后的MG63细胞Bak1 m RNA及蛋白的表达,筛选出能高效沉默目标基因的重组腺病毒表达载体,并对其进行包装扩繁,荧光显微镜观察计算病毒滴度,利用MTT法检测高效沉默的重组腺病毒感染MG63细胞后的细胞活性。结果 (1)测序列结果表明,sh RNA序列已成功克隆入到p Ad-GFP载体上;(2)sh RNA-3的沉默效率最高,扩增纯化后腺病毒滴度达到7.7×108GFU/ml;(3)MTT检测显示与NC对照组相比,sh RNA-3组MG63细胞活性增强(P<0.5)。结论成功构建了沉默Bak1的重组腺病毒,为进一步研究Bak1的功能奠定了基础。

摘要：目的构建人B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)过表达载体p ENTER-Bcl2,检测其在人成骨肉瘤细胞中的表达及对细胞活性的影响。方法利用q PCR扩增Bcl2全长c DNA,构建表达载体p ENTER-Bcl2,经测序证实后将其转染至人成骨肉瘤细胞(MG63)中,利用q PCR和Western blot方法检测Bcl2的表达,利用MTT检测细胞活性。结果DNA测序结果显示构建的p ENTER-Bcl2载体表达与实验设计相符;Ad-Bcl2组Bcl2 mRNA表达较NC对照组和空白对照组高(P均<0.01);Ad-Bcl2组Bcl2蛋白表达较NC对照组和空白对照组高(P<0.05,P<0.01);与NC对照组比较,Ad-Bcl2感染细胞活性增强(P<0.05)。结论构建的p ENTER-Bcl2能在MG63细胞中过表达Bcl2;AdBcl2可以提高细胞的活性,这为研究Bcl-2在骨质疏松发生时的分子生物学机制奠定了基础。