摘要：目的:克隆化HcV非结构蛋白2(NS2)蛋白反式调节靶基因(NS2TP). 方法:依据我们构建的HcV NS2反式调节基因差异表达的cDNA消减文库筛选结果,利用分子生物学与生物信息学技术获得新基因NS2TP的编码序列,设计特异性引物,并对其进行克隆化研究. 结果:NS2TP基因编码区为456核苷酸(nt),编码产物为151氨基酸残基(aa),经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,属于未知功能新基因. 结论:发现了HcV

摘要：目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HcV)核心蛋白反式激活基因TAHccP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TAHccP1在肝细胞中上调或下调的基因,探索其可能的调节功能. 方法:设计并合成TAHccP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PcR)技术扩增TAHccP1基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的TAHccP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TAHccP1,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA,逆转录为cDNA,应用基因表达谱芯片技术对两组间差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:在筛选的1 152点cDNA芯片中,有110种基因的表达水平上调(占9.55%),98种基因的表达水平下调(8.51%),包括一些与体内免疫调节、脂类代谢、蛋白质的翻译合成、氧化反应、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的基因. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了TAHccP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TAHccP1蛋白可能的生物学功能提供依据.

摘要：生物学和医学的研究发展很快,不断有新的理论和技术出现,推动着生物学和医学领域的不断发展.现代分子生物学技术和理论为肝脏病学的研究提供了前所未有的机遇.由于发展不平衡,对于新理论和新技术的接受程度和推广还有一段艰难的过程.在这一过程中,不可避免地存在一些认识上的误差和偏差.因此本文选取3个有代表性的例子, 阐明科学研究的设计和方法中的科学性.

摘要：目的:乙型肝炎病毒(HBV)基因组内部结构基因与编码基因之间相互重叠,是基因组序列高度集中利用的一个典型。早期研究中确定了编码病毒蛋白的4个开放读码框架(ORF),本研究通过对于中国HBV感染者的流行病毒株的基因序列进行分析比较,阐明基因组结构的特点,并探索是否存在新型ORF的可能性。方法:考虑到HBV基因组序列的准种特点以及多聚酶链反应(PcR)技术的精确度,我们采用的技术是长距离且精确PcR(LA-PcR)技术,根据中国HBV患者的病毒基因序列设计PcR扩增用引物,自慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列,克隆入pGEM Teasy质粒,挑选克隆进行全基因组DNA测序,与其他HBV基因组序列进行比较。结果:测序结果5株HBV全基因组核苷酸序列存在一新的ORF,定义为前-前-S区,并发现该区之前存在一TA富集区,提示存在新型启动子的可能性。新界定的前-前-S区ORF编码氨基酸序列为MQLIITSKLGIIYILcGRLVFYIREKLHAVPHFVGHHILGNKSYS,与前-S1、前-S2和表面抗原主蛋白编码基因框架一致表达。结论:在HBV基因组中存在有一新的ORF,命名为前-前-S区。

摘要：病毒载量动力学的检测被越来越广泛地用来预测抗病毒药物的治疗效果,先前的免疫学检测受很多因素的影响,已不能正确反应病毒的复制.而病毒载量定量检测可使人们能够比较清楚地了解病毒在体内的变化情况,弥补了免疫学方面的不足.通过对病毒动力学的研究可以使我们了解病毒在清除过程中的特点,从而用于指导临床来评估药物疗效,以及针对不同的患者设计合理的治疗方案.

摘要：目的:利用分子生物学技术,研究乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)的反式激活作用,克隆HBxAg反式激活作用的靶基因,为进一步探索HBxAg的反式激活作用,以及反式激活作用的靶基因,阐明HBV感染引起慢性肝炎、肝细胞癌(Hcc)发生发展的分子生物学机制,为探索新型预防和治疗技术、寻求新型途径奠定理论基础。方法:利用聚合酶链反应(PcR)技术,扩增HBxAg的编码基因,构建表达载体pcDNA3.1(-)-X,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,与转染空白载体的HepG2细胞对照组分别提取总mRNA,并进行抑制性消减杂交(SSH)分析。对于获得的差异表达基因片段序列的同源性基因进行搜索,确认为与已知的功能基因无同源性之后,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,完成新基因序列的确定。然后自HepG2细胞提取总mRNA,应用生物信息学技术确定的新基因的序列设计特异性引物,进行逆转录多聚酶链反应(RT-PcR)技术的扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果:PcR技术扩增获得的HBxAg基因序列,经过限制性酶切鉴定和序列测定证实无误。转染HepG2细胞并提取足量的mRNA,利用SSH技术进行分析,获得的基因片段序列分析结果表明,其中之一为新型基因片段序列,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过对EST数据库中注册的基因片段序列同源性的搜索和比对,电子拼接成功,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总mRNA,以RT-PcR技术,扩增获得该新基因的全基因序列,并测序证实,命名为XTP1,在GenBank中注册,注册号为AF488828。结论:利用分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HBxAg的反式激活作用的新基因XTP1,并为进一步研究HBxAg的反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础。

摘要：目的:研究β2-m对核心启动子表达的调节作用方法:根据HBV核心启动子及β2-微球蛋白的序列设计引物,用聚合酶链反应(PcR)的方法分别扩增HBV核心启动子和β2-微球蛋白基因,分别构建HBV核心启动子的报告载体及β2-微球蛋白的真核表达载体,脂质体法瞬时转染HepG2细胞.结果:成功构建HBV核心启动子的报告载体及β2-微球蛋白(β2-m)的真核表达载体.脂质体法瞬时转染HepG2细胞48h后,核心启动子在β2-微球蛋白(β2-m)的影响下,其启动子活性降底2倍.结论:β2-微球蛋白(β2-m)

摘要：目的:构建HBV核心启动子及NPIP的重组载体,研究NPIP对核心启动子表达的调节作用.方法:根据HBV核心启动子及NPIP的序列设计引物,用聚合酶链反应(PcR)的方法分别扩增HBV核心启动子和NPIP基因,分别构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真核表达载体,脂质体法瞬时转染HepG2细胞.结果:成功构建HBV核心启动子的报告载体及NPIP的真核表达载体.脂质体法瞬时转染HepG2细胞48h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在NPIP的影响下,其活性有降低3-4倍.通过体内实验证明NPIP可以下调HBV核心启动子的表达.结论:NPIP明显降低HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的线索.

摘要：目的:乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBcAg)在HBV感染的肝细胞中可同时存在于细胞核和胞质中,对于病毒前基因组RNA装配入核壳体是必须的,HBcAg还是HBV介导体液免疫反应和cD4^+T细胞免疫反应的重要抗原,寻找人肝细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用蛋白的基因,是研究HBcAg生物学功能的重要途径。方法:用多聚酶链反应(PcR)法扩增HBcAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pAcT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PcR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析。根据Genbank的信息设计新基因的引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录PcR扩增出c-12＃新基因的完整序列,连入另一酵母表达载体pGADT7,并转化进酵母细胞Y187,再次与转化了诱饵质粒的酵母细胞AH109配合(回交),以进一步证实HBcAg与c-12＃新基因编码蛋白的结合作用。结果:成功克隆出HBcAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落16个,其中未知基因4个。用自行设计的引物成功地从HepG2细胞的mRNA中扩增出c-12＃新基因的完整序列,回交实验再次证实二者之间的结合作用。结论:成功克隆出HBcAg的肝细胞结合蛋白,发现未知功能基因,为进一步研究HBcAg在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索。

摘要：目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HcV)非结构蛋白3(NS3)反式激活基因1(NS3TP1)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步NS3TP1蛋白可能的分子生物学功能. 方法:设计并合成NS3TP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PcR)技术扩增NS3TP1蛋白编码基因片段, 以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)- NS3TP1.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较. 结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有26个基因表达水平显著上调,14个基因表达水平显著下调. 结论:应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS3TP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS3TP1蛋白可能的生物学功能及HcV的致病机制提供理论依据.