摘要：目的：在大肠杆菌中研究小肽促进α-突触核蛋白（α—synuclein，α—Syn）（A53T，S129A）的正常折叠。方法：利用分子生物学和生物信息学技术，以α-Syn的疏水区域为基础，设计了4种小肽（Pn：P1-P4）；构建融合蛋白α-Syn—GFP，使α-Syn基因位于GFP上游，各种小肽以双顺反子方式与α-Syn—GFP共同表达；以文献报道的有效促进α-Syn正常折叠的小肽Pc（MGGAVVTGR）为对照，利用融合蛋白折叠在细菌中可视化技术研究小肽Pn影响α-Syn（A53T，S129A）的正常折叠的效果。结果：4种小肽均能更好地促进α-Syn（S129A）的正常折叠；和对照Pc相比，小肽P2（MRGGAVVTGR）使α-Syn（A53T）正常折叠提高了10％，小肽P4（MRVGGAVVR）使α-Syn（S129A）正常折叠提高了83％。结论：在大肠杆菌中，小肽可以不同程度的促进α-Syn（A53T，S129A）的正常折叠。

摘要：通过设计PCR引物,从pcDNA3.1-α-syn载体中扩增人α-突触核蛋白的编码DNA序列,将其克隆至PGEX-5X-1载体中,成功构建了人α-突触核蛋白高效原核表达载体pGEX-5X-1-syn。转化BL21菌株后进行IPTG诱导,通过对诱导剂浓度、诱导时间和温度、纯化方法和原纤维培养条件的优化,获取了重组人α-突触核蛋白原纤维,采用硫黄素T染色和透射电镜方法确认原纤维的制备情况。结果发现,经终浓度为1.0 mmol/L的IPTG,37℃条件下诱导3 h,人α-突触核蛋白得到大量表达。采用GST融合蛋白纯化磁珠进行蛋白纯化,可快速高效获取高纯度的人α-突触核蛋白,纯化产量可达到25 mg/L。浓度为9 mg/mL的人α-突触核蛋白,在37℃,1000 r/min震荡条件下培养至6 d,可大量成功制备人α-突触核蛋白原纤维,并在透射电镜下成功观察到了原纤维的形态。α-突触核蛋白原纤维是建立PD模型的重要材料,以上结果建立了一套可快速高效制备重组人α-突触核蛋白原纤维的方法,为PD的动物模型及细胞模型的建立提供了重要的研究材料。

摘要：目的克隆编码大鼠α-突触核蛋白的cDNA,探讨α-突触核蛋白基因在原核细胞中的表达过程并制备基因重组型α-突触核蛋白。方法设计合成含适当酶切位点的DNA片段作为引物,采用RT-PCR法从Wistar大鼠脑总RNA中扩增编码α-突触核蛋白的cDNA并亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),使其表达以谷胱甘肽S转移酶(glutathione-S-transferase,GST)为标签的融合蛋白质。用凝血酶定点分解融合蛋白,再用谷胱甘肽-琼脂糖4B和Superdex S200纯化基因重组型α-突触核蛋白。结果核酸序列测定表明克隆的cDNA含420 bp编码140个氨基酸,重组质粒pGEX-raSYN在原核细胞中表达为可溶性组分并受IPTG诱导,纯化的目的蛋白质在SDS-PAGE上表现为单一条带,推测其相对分子质量约为18 000。每升细菌培养液可纯化目的蛋白质3 mg。Western blot分析结果表明纯化的目的蛋白质可以被抗α-突触核蛋白识别。结论大鼠α-突触核蛋白基因在原核细胞高效表达,可制备高纯度基因重组型大鼠α-突触核蛋白。

摘要：帕金森病(PD)是与衰老相关的常见的神经退行性疾病。近年来,有关PD的动物模型研究和对来自PD患者的脑标本的分析发现多巴胺能神经元中非受体酪氨酸激酶Abelson(c-Abl)的水平和活性增加。c-Abl具有蛋白质底物磷酸化活性,可使α-突触核蛋白和E3泛素连接酶Parkin磷酸化。临床上用于治疗白血病的c-Abl激酶抑制剂,在PD的细胞和动物模型均中显示出神经保护作用,这为临床上使用c-Abl抑制剂治疗PD患者提供了良好的应用前景。文章就c-Abl及其与PD发生发展的病理生理过程的关系进行综述,并对目前c-Abl抑制剂的药理学和安全性相关的问题进行了讨论。c-Abl抑制剂是否能够真正用于临床治疗PD使更多患者受益,仍需要更严格控制、设计良好的试验做进一步的研究。

摘要：目的对猫突触核蛋白（α-synuclein）进行克隆、表达及纯化,并探讨其生物信息学特征。方法在Genebank中α-synuclein基因的保守区域内设计引物,从猫脑c DNA文库中PCR扩增得到猫的α-synuclein基因,再将此基因双酶切后克隆到p ET28a原核表达载体中,构建重组质粒,测序正确的重组质粒转化BL21（DE3）大肠杆菌,采用IPTG诱导表达。然后对猫α-synuclein氨基酸的同源性和疏水性进行分析。结果实验成功从猫脑c DNA文库中扩增出α-synuclein基因,基因全长381个碱基,编码126个氨基酸。获得的全长基因成功克隆进入p ET28a,最后转染大肠杆菌BL21（DE3）,获得可溶性表达的α-synuclein蛋白质,蛋白质分子量为13.12k D,与预期分子量一致。生物信息学分析显示猫α-synuclein蛋白与人源及鼠源α-synuclein氨基酸具有很高的同源性,分别为87.35%和83.15%,但是与鼠和人的氨基酸序列比较,猫α-synuclein氨基酸缺失41～54位氨基酸。蛋白质结构预测显示猫α-synuclein具有很好的疏水性,有助于诱导表达时形成可溶性蛋白,这一结果在本研究中得到证实。结论本研究首次克隆了猫α-synuclein基因,并在大肠杆菌中实施了可溶性表达,为后期研究α-synuclein的进化、蛋白晶体结构、生物学功能和帕金森动物模型的构建奠定了一定的基础。

摘要：目的建立一种定量检测小鼠α-突触核蛋白基因(α-syn)内含子1甲基化水平的方法,分析不同脑区该区域甲基化水平的差异。方法使用MSPPrimer确定小鼠α-syn内含子1的CpG岛区域。使用PyroMark assay design 2.0针对该CpG岛设计焦磷酸扩增及测序引物。采用焦磷酸测序法分析成年小鼠海马、皮质、纹状体及中脑四个脑区该区域甲基化水平。结果小鼠α-syn内含子1存在CpG岛。成功优化定量该CpG岛甲基化水平的焦磷酸测序方法。焦磷酸测序表明各脑区该区域甲基化均低于2%。结论建立了定量检测小鼠α-syn基因内含子1CpG岛甲基化水平的方法。该CpG岛甲基化对于成年小鼠各脑区中α-syn的表达不起主要调控作用。