摘要：目的观察α-synuclein过度表达诱导HEK293细胞α-synuclein蛋白病理性积聚的作用。方法将消除终止密码子α-synuclein基因扩增产物连入pGEMT-easy载体,DNA测序证实后亚克隆入增强型绿色荧光蛋白pEGFP-N1质粒,通过限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。采用脂质2000将野生型α-synuclein-EGFP真核表达载体转染HEK293细胞,48h后采用Axiovert200型倒置荧光显微镜、荧光免疫细胞化学观察其在细胞内的表达,HE染色观察细胞胞浆内嗜酸性小体的形成。结果消除终止密码子的扩增序列经测序证实并亚克隆入pEGFP-N1质粒后,限制性内切酶酶切鉴定质粒大小、酶切位点上均符合实验设计。将野生型α-synuclein-EGFP真核表达载体转染HEK293细胞,48h后荧光显微镜下观察细胞在波长488nm蓝色激发光下发出明亮的绿色荧光,其中某些细胞出现绿色荧光物质积聚;免疫荧光细胞化学检测,EGFP阳性细胞同时也表现为a-synuclein免疫反应阳性,某些细胞胞浆内可见α-synuclein免疫阳性产物聚集;HE结果发现一些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体形成,约占细胞总数的10.8%。结论野生型α-synuclein基因过表达可诱导α-synuclein蛋白在HEK293细胞内积聚,胞浆内嗜酸性小体形成。

摘要：目的构建并筛选针对帕金森病致病基因α-synuclein特异、高效的RNA干扰载体，观察应用RNA干扰技术阻断α-synuclein过表达导致α-synuclein蛋白病理性积聚的作用。方法采用携带Hl启动子的PBSHHl质粒，设计并构建针对α-synuclein基因4个可有效表达发夹状RNA的特异性α-synuclein基因干扰载体pSVNi-1、pYNi－2,pSYNi－3、pSVNi－4，通过限制性内切酶酶切、DNA测序证实后，转染HEK293细胞，应用Western印迹、逆转录－PCR观察干扰载体的有效性，筛选特异、高效的RNA干扰载体。采用脂质2000将筛选的最佳α-synuclein-pBSHI RNA干扰载体及野生型α-synuclein-pEGFP真核细胞表达载体共转染HEK293细胞，并设立对照组，48h后采用Axiovert200型倒置荧光显微镜、荧光免疫细胞化学观察其在细胞内的表达，HE染色观察细胞质内嗜酸性小体的形成。结果Western印迹、逆转录－PCR结果显示，pS,CNi－1载体具有高效的RNA干扰抑制作用，效率达69．6％；将α-synuclein-pBSHHl RNA干扰载体pSYNi-1及野生型α-synuclein-pEGFP真核细胞表达载体转染HEK293细胞，48h后荧光显微镜下观察细胞在波长488nm蓝色激发光下发出明亮的绿色荧光，其中对照组某些细胞质内出现绿色荧光物质积聚，而转染psyni-1干扰组细胞质内绿色荧光物质分布均匀；免疫荧光细胞化学检测结果显示，转染48h后对照组可见α-synuclein免疫阳性产物在胞浆内聚集，转入RNA干扰载体pYNi-1后胞浆内α-synuclein免疫阳性产物分布均匀；HE结果显示，转染48h后，对照组某些细胞质内出现圆形的嗜酸性小体（类Lewy小体）形成；转入RNA干扰载体pSVNi-1后胞浆内未见类Lewy小体形成。结论RNA干扰技术通过抑制α-synuclein基因的表达，成功阻断了野生型α-synuclein过表达所诱导的α-synuclein蛋白病理性积聚，为最终应用RNA干扰技术临床治疗帕金森病提供了某些依据。