摘要：为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δc和δNS基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PcR方法,针对δc、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因β-actin引物,将常规PcR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PcR检测δc、δNS基因及内参基因β-actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R2均在0.99以上;最小检出量为10拷贝/μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PcR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δc和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。

摘要：为了从引起雏鸭肝脏出血、脾脏白色坏死的临床病例中分离新型鸭呼肠孤病毒(novel Duck reovirus,NDRV)毒株并研究其致病力,试验根据鸭呼肠孤病毒S3基因序列设计1对特异性引物,对发病番鸭肝脏、脾脏组织研磨液进行RT-PcR鉴定,并将研磨液无菌处理后接种Vero细胞分离病毒,根据鸭呼肠孤病毒S1基因(包括δc基因)设计引物对分离毒株的δc基因进行克隆测序,以GenBank中部分毒株序列为参考,进行遗传进化分析,构建系统发育树。以剂量为2×10^(5)TcID_(50)细胞病毒液对1日龄番鸭进行颈部皮下注射,进行动物回归试验。结果表明:特异性RT-PcR检测组织病料研磨液为阳性,在Vero细胞上连续传至5代出现明显的细胞融合现象且能稳定传代,病毒含量为1×10^(-4.33)TcID_(50)/0.1 mL。δc基因克隆测序结果在NcBI上进行BLAST比对显示,分离毒株与2009年以来公布的部分NDRV毒株核苷酸序列相似性为98.45%~99.17%,高度相似。以δc基因构建系统发育树显示,该分离毒株处于水禽呼肠孤病毒基因2型分支,与水禽呼肠孤病毒基因1型和禽源呼肠孤病病毒距离较远。攻毒雏番鸭死亡率为40%,剖检发现肝脏出血,脾脏肿大,有轻微坏死灶或大面积坏死灶,有些质地较硬,肝细胞变性坏死、淋巴细胞浸润,脾脏淋巴细胞缺失,可见大面积坏死灶。说明本试验成功分离到1株NDRV流行毒株,且毒力较强。