摘要：为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量rt-pcr技术。结果显示,该方法的敏感性可达102拷贝/μL,除H1亚型SIV外,对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。本试验结果表明该方法特异性强、重复性好,有望成为一种特异、敏感、快速、定量检测H1亚型SIV的方法。

摘要：【目的】建立一种检测罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV）的实时荧光定量rt-pcr,为防控罗氏沼虾白尾病（White tail disease,WTD）提供技术支持。【方法】将MrNV衣壳蛋白基因片段（***287005）克隆到pGM-T载体,选取阳性重组质粒用SalⅠ酶切获得线性化转录模板DNA,经体外转录获得标准品RNA;在MrNV基因序列的保守区域设计1对扩增片段为119 bp的特异性引物,以标准品RNA为模板进行引物浓度筛选及标准曲线制定,并对建立的检测方法进行标准曲线和融解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】建立的一步法实时荧光定量rt-pcr定量范围宽,检测模板范围在1×10~1~1×10~8拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系;融解曲线表现为单一波峰,Tm为81.17~81.25℃;扩增曲线呈明显的S形,以C_t值35.00为界限,灵敏度约为10个病毒粒子,是常规rt-pcr的1000倍。该方法仅对MrNV具有良好的特异性,其组内和组间试验的Ct值变异系数分别为0.15%~0.83%和0.56%~0.95%;对83份罗氏沼虾临床样品进行检测,其结果与套式rt-pcr的检测结果一致。【结论】针对MrNV检测建立的一步法实时荧光定量rt-pcr具有快速、便捷、灵敏、准确等优点,且对样品的检测范围宽,适用于MrNV隐性感染和发病诊断。