摘要：目的响应面法优化三叶青块根黄酮的提取工艺,测定9种单体物质的含量,评价黄酮的体外抗氧化活性。方法根据中心组合设计,对提取温度、提取时间、甲醇浓度、液料比4个因素进行考察,以三叶青黄酮得率为指标优化提取工艺。采用超高效液相色谱分析9种黄酮单体的含量。以DPPH自由基和羟自由基清除率为指标评价总黄酮的体外抗氧化能力。结果确定的优化工艺条件为提取温度78℃,提取时间92 min,甲醇浓度78%,液料比15∶1,总黄酮得率为1.725%,通过中试验证,总黄酮得率为1.709%。异荭草苷、荭草苷、芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素、芹菜素和山柰酚含量依次为119.6、25.3、26.4、28.8、41.6、30.4、150.8、18.1、20.6μg·g^(-1)。总黄酮对DPPH自由基和羟自由基的清除率高达92.56%和72.96%,IC50值分别为0.061 mg·mL^(-1)与0.115 mg·mL^(-1)。结论确定的提取工艺稳定、高效、经济,可用于三叶青黄酮的提取,所得提取物具强抗氧化活性。

摘要：目的克隆三叶青Tetrastigma hemsleyanum的扩展蛋白家族基因,对其进行器官表达分析,并初步探讨其功能。方法根据Gen Bank中登录的扩展蛋白基因保守区域序列设计1对简并引物,以三叶青球形块根c DNA为模板进行RT-PCR扩增,再结合RACE技术,获得三叶青扩展蛋白基因全长c DNA序列,命名为Th-exp。采用半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析Th-exp基因在不同器官中的表达情况。结果克隆获得扩展蛋白家族基因,共782 bp,其中包含630 bp开放阅读框,编码209个氨基酸(Gen Bank登陆号KP693606)。Th-exp编码的蛋白质具有典型的扩展蛋白结构特征,N端含有8个半胱氨酸的结构域,C端含有4个保守的色氨酸结构域,中间含有组氨酸功能域。Blast分析显示,Th-exp与葡萄、醉蝶花中扩展蛋白基因具有相似性。半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析表明,Th-exp在三叶青叶、茎、普通细根和球形块根中均有表达,但球形块根中表达强于其他器官。结论克隆得到三叶青扩展蛋白家族基因Th-exp全长c DNA,初步预测其参与了三叶青块根的发育过程。

摘要：为研究三叶青Tetrastigma hemsleyanum在浙江省的最佳栽培技术模式,以江西上饶种源为对照,采用4个试验种源(温州种源、金华种源、衢州种源和丽水种源)、4种栽培方式(地栽、下铺无纺布地栽、无纺布袋及控根容器)及4种基质(油茶林下腐殖土、40%专用基质+60%黄心土、30%锯末+60%黄心土+10%石砾、菜地土+10%草木灰)在浙江遂昌(试验地Ⅰ)、云和(试验地Ⅱ)及永康(试验地Ⅲ)分别设置3个试验地进行油茶Camellia oleifera林下仿野生栽培多点试验,利用正交试验设计17个技术处理结合方差分析对4年生三叶青块根产量及总黄酮含量进行综合评价,筛选适合浙江省的林下栽培技术模式。结果表明,在试验地Ⅰ和试验地Ⅱ土壤基质对单株块根鲜质量影响最大,而在试验地Ⅲ栽培方式对单株块根鲜质量影响最大;3个试验地均表现为种源对块根总黄酮含量影响最大;针对单株块根鲜质量,金华种源、控根容器栽培方式或无纺布袋栽培方式(无显著差别)、40%专用基质+60%黄心土栽培基质表现最佳;针对块根总黄酮含量,丽水种源、地栽方式、菜地土+10%草木灰栽培基质表现最佳。

摘要：浙江省淳安县三叶青叶部病害发生危害严重,对当地三叶青生产造成了巨大的经济损失;明确其病原菌种类与生物学特性,可为病害的有效防控提供理论依据。采用常规组织分离法对病原菌进行分离,利用病原菌形态学、分子系统学(rDNA-ITS、β-tubulin、ACT、gpd、CaM基因的PCR扩增、序列分析和系统发育树的构建)和致病性测定相结合的方法,将为害三叶青的病原菌鉴定为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides);并采用十字交叉法和血球计数板计数法对该菌的生物学特性进行了研究。结果表明:菌株CA-2在20~35℃均能生长,最适菌丝生长和产孢的温度均为25℃;24 h暗培养最利于菌丝生长和产孢;培养基pH为5.0最利于菌丝生长,而pH为8.0最利于产孢。菌株CA-2能利用多种碳、氮源营养,但存在一定的差异;其中,菌丝在以麦芽糖和山梨醇为碳源、牛肉浸膏为氮源的培养基上生长最快,在以乙醇为碳源、谷氨酰胺为氮源的培养基上最慢;产孢量在以山梨醇为碳源、酵母膏为氮源的培养基上最大,在以甘露醇为碳源、胰蛋白胨为氮源的培养基上最少。

摘要：目的建立浙江和江西产的三叶青(Tetrastigma hemsleyanum)SRAP-PCR的反应体系和扩增程序。方法应用L9(34)正交设计方法,以三叶青基因组DNA为模板,研究了Mg2+、dNTP、引物和模板DNA 4种PCR反应组分浓度变化对扩增结果的影响,根据梯度PCR仪引物的条带数量及清晰度选择退火温度。结果优化后的25μL反应体系包含:10×PCR buffer2.5μL,2.5mmol/L MgCl2,0.15mmol/Ld NTP,0.15μmol/L引物,1.0U Taq DNA聚合酶,50ng DNA模板。扩增程序的最佳退火温度为51℃。并筛选出8对扩增产物丰富,多态性好的引物。结论正交设计优化的三叶青SRAP反应体系,经过10份样品检验,证明该体系稳定可靠,多态性好,可用于三叶青遗传多样性分析。

摘要：目的探讨氮素形态对三叶青块根主要化学成分含量和抗氧化活性的影响,为三叶青人工栽培科学施氮提供依据。方法以三叶青为研究材料进行容器栽培实验。采用随机区组设计,3次重复,设置0∶100,25∶75,50∶50,75∶25,100∶0等5个不同NH4^(+)-N/NO_(3)^(-)-N处理及酰胺态氮、不施氮处理。连续施氮2年后,采收、测定三叶青块根多糖、总黄酮、总酚含量和抗氧化活性(ABTS和FRAP),应用方差分析、相关分析、聚类分析、主成分分析等统计学方法分析氮素形态对三叶青块根化学成分含量和抗氧化活性的影响。结果氮素形态对三叶青块根多糖含量影响不大,对总黄酮、总酚含量和抗氧化活性影响较大。随铵态氮比例的升高,三叶青块根总黄酮、总酚含量和抗氧化活性均表现为先显著降低,至NH4^(+)-N/NO_(3)^(-)-N为75∶25时急剧升高,并在NH4^(+)-N/NO_(3)^(-)-N为100∶0时达到最大。全铵态氮处理总黄酮、总酚含量和抗氧化活性也显著高于全酰胺态氮、全硝态氮和不施氮处理。结论氮素形态及配比对三叶青块根的化学成分含量和抗氧化活性影响显著,NH4^(+)-N/NO_(3)^(-)-N为75∶25和100∶0时,较有利于三叶青块根总黄酮、总酚的累积和抗氧化活性的提高。

摘要：目的构建三叶青ISSR反应体系,为三叶青种质资源遗传多样性分析、品种选育与分子鉴定奠定基础。方法用常规CTAB法、SDS法、改良CTAB法、试剂盒法提取三叶青叶片基因组DNA,采用正交设计试验L12(34),在4个主要因素的3个水平上进行ISSR体系构建,用12个不同种源三叶青样品验证体系稳定性。结果改良CTAB法提取的三叶青叶片基因组DNA质量最好,纯度高,试剂盒法次之,常规CTAB法与SDS法所提DNA质量较差。构建的ISSR最佳反应体系为:20μl反应体系中,Taq酶用量0.5U,模版DNA20ng,d NTPs0.20mmol/L,引物0.4μmol/L,2μl 10×Buffer缓冲液(Mg2+浓度1.5mmol/L)。结论采用正交设计方法构建的三叶青ISSR体系经检验,稳定可靠,可用于三叶青种质资源遗传分析。

摘要：目的研究乙醇溶剂提取三叶青中总黄酮的最佳工艺条件。方法以乙醇溶液为提取溶剂,采用响应面设计方法,对影响总黄酮提取效果的3个因素乙醇浓度(C)、液料比(R)、提取时间(t)进行中心组合设计试验,并建立数学模型,研究这些因素对黄酮提取率的影响。结果中心组合设计试验建立总黄酮提取率与乙醇浓度(C)、液料比(R)及提取时间(t)间的数学模型显著,R2=0.9502;最佳的提取工艺条件为28%乙醇(V/V),液料比22(ml/g),提取时间2.2h;经提取次数考察,最佳提取次数为2次。该条件下三叶青总黄酮的提取率为0.30%。结论验证试验结果表明,应用响应面方法优选出的工艺稳定、合理、可行。

摘要：目的优选三叶青热风干燥工艺。方法以干燥后药材中总黄酮、多糖、总多酚和β-谷甾醇为评价指标,采用CRITIC法计算权重系数,结合正交设计法,考察润软时间、切片厚度和干燥温度对干燥工艺的影响。结果 CRITIC法得出三叶青中总黄酮、多糖、总多酚和β-谷甾醇权重系数分别为0.21,0.34,0.19,0.26,正交设计法得出热风干燥最佳工艺条件为润软3 h,切片厚度7 mm,干燥温度60℃,总黄酮、多糖、总多酚和β-谷甾醇含量分别为18.1,91.3,8.81,0.36mg·g^(-1)。结论 CRITIC法确定的权重系数客观、真实,可以反映三叶青药材中各活性成分信息;优选得到的热风干燥工艺稳定可行,重复性好,适合产业化推广。

摘要：为了对水蛭分子标记基因进行序列分析,试验选择mt DNA的序列基因为目标基因,设计1对特异性引物,用于对水蛭成分和三叶青进行检测。结果表明:水蛭中有性状差异较大的人工压制伪品,尤其是以三叶青为代表的植物生品,通过对PCR扩增体系的优化,该检测方法能实现对水蛭成分和三叶青进行快速、准确地检测,具有很好的特异性及灵敏度。