摘要：目的探讨湿生扁蕾总[口山]酮介导TGF-β/Smad和自噬相关通路对NCM460细胞上皮间质转化(EMT)的影响。方法采用2.5μg/mL脂多糖(LPS)持续干预细胞14 d建立EMT模型,CCK-8法筛选最佳湿生扁蕾总[口山]酮给药剂量。设计空白组、模型组、吡菲尼酮组(200μg/mL)和湿生扁蕾总[口山]酮低、中、高剂量组(50、100、200μg/mL),采用Western blot法检测细胞ZO-1、α-SMA、Beclin-1、P62、Bcl-2、LC3B蛋白表达,RT-qPCR法检测细胞ZO-1、α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、Snail1 mRNA表达,免疫荧光观察细胞中α-SMA表达,TUNEL染色观察细胞凋亡情况,MDC染色和透射电镜分别观察细胞中自噬囊泡和自噬小体数目。结果湿生扁蕾总[口山]酮质量浓度小于200μg/mL时对细胞活率无明显影响(P>0.05),故选择50、100、200μg/mL为低、中、高剂量组。与空白组比较,模型组细胞ZO-1、Beclin-1、Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白和ZO-1 mRNA表达降低(P<0.01),α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、Snail 1 mRNA和α-SMA、P62蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较,湿生扁蕾总[口山]酮组均能改善以上指标(P<0.05,P<0.01)。结论湿生扁蕾总[口山]酮能抑制NCM460细胞EMT发生进程,其机制可能与抑制TGF-β/Smad通路和增强细胞自噬有关。

摘要：目的探讨Zeste基因增强子同源物2(EZH2)抑制剂对膀胱癌T24细胞上皮间质转化(EMT)的影响及其作用机制。方法取对数生长期T24细胞,随机分为空白组、GSK126低剂量组、GSK126中剂量组、GSK126高剂量组,每组设置5个复孔,分别用终浓度为0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的GSK126细胞培养基培养。采用MTT法检测培养24 h、48 h、72 h细胞增殖能力,Transwell法和划痕实验检测培养48 h细胞侵袭和迁移能力,qRT-PCR和Western blotting检测培养48 h细胞中上皮间质标志物E-cadherin、Vimentin、β-catenin及EZH2 mRNA和蛋白相对表达量。结果空白组及GSK126低、中、高剂量组细胞培养24 h、48 h、72 h的增殖能力比较,采用重复测量设计的方差分析,结果:①不同时间细胞增殖能力有差异(F=15.498,P=0.000);②4组细胞增殖能力有差异(F=5.162,P=0.013);③4组细胞增殖能力变化趋势有差异(F=12.314,P=0.000)。与空白组比较,GSK126低、中、高剂量组穿膜细胞数、迁移率,以及EZH2、Vimentin、β-catenin mRNA和蛋白相对表达量均降低(P<0.05),且随GSK126剂量升高而降低(P<0.05)。与空白组比较,GSK126低、中、高剂量组E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量均升高(P<0.05),且随GSK126剂量升高而升高(P<0.05)。与空白组比较,GSK126低、中、高剂量组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白相对表达量均降低(P<0.05),且随GSK126剂量升高而降低(P<0.05)。结论EZH2抑制剂可有效抑制膀胱癌T24细胞EMT,其调控机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路中JAK2和STAT3蛋白磷酸化有关。

摘要：干扰素调节因子6(interferon regulatory factor 6,IRF6)基因突变在单纯型和综合征型唇腭裂中均有报导。然而,其基因突变如何导致了唇腭裂的病理发生目前尚不清楚。本文以培养细胞为模型,研究了IRF6基因沉默对细胞增殖、迁移、凋亡以及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,从而探讨唇腭裂形成的可能的分子病理机制。采用分子克隆技术构建IRF6真核过表达载体;设计合成IRF6基因特异siRNA,成功构建IRF6基因沉默和过表达细胞模型;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫印迹法(Western blot)检测转染siRNA-IRF6质粒48 h时,发现IRF6的mRNA和蛋白质表达均降低2倍;CCK8法检测转染siRNA-IRF6后,对细胞增殖能力提高1.98倍;划痕法观察转染siRNA-IRF6质粒72 h后检测细胞的迁移能力,比对照组增强2.36倍;利用Western印迹、qRT-PCR检测EMT标志性分子E-钙黏着蛋白(E-cadherin),发现过表达IRF6后EMT有显著降低。与对照相比,E-钙黏着蛋白表达下调3.57倍;流式细胞技术检测IRF6时未发现对细胞凋亡有影响。在体外培养细胞模型中,IRF6基因沉默显著促进了细胞的增殖和迁移,抑制EMT发生。提示IRF6这一唇腭裂相关基因有可能通过影响上述细胞事件,而导致唇腭裂的病理发生。

摘要：目的探讨ALKBH5对肝癌细胞迁移、侵袭能力及上皮间质转化(EMT)的影响。方法选择手术切除的肝癌标本50例,分析ALKBH5与临床病理学参数的关系。设计ALKBH5短发夹核糖核酸(shRNA)序列,构建pLKO.1-TRC vector载体,慢病毒感染肝癌细胞HepG2和SMMC7721,嘌呤霉素筛选并培养稳定低表达ALKBH5细胞株;检测ALKBH5 mRNA及ALKBH5蛋白质水平干扰效率;Transwell实验检测细胞的迁移及侵袭;蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞EMT相关蛋白的影响。结果肝癌中ALKBH5蛋白表达与分化程度、临床分期存在相关性(P0.05);下调肝癌细胞ALKBH5表达,对照组和实验组HepG2细胞迁移数目分别为(123±22)、(335±21)个,侵袭数目分别为(118±29)、(282±17)个;对照组和实验组SMMC7721细胞迁移数目分别为(220±27)、(453±23)个,侵袭数目分别为(200±11)、(388±20)个,2组间差异均有统计学意义(P<0.05)。下调ALKBH5表达后,E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平降低,波形蛋白(Vimentin)、锌指结构转录抑制因子(Snail)表达水平增高。结论ALKBH5扮演了抑癌基因的角色,下调ALKBH5表达能够促进肝癌细胞的迁移、侵袭及EMT。

摘要：自噬是细胞清除老化元件和受损蛋白的过程,与肿瘤的产生和进展有密切联系。上皮间质转化(EMT)是上皮表型的细胞经过一系列变化获得侵袭和迁移能力,产生间质特性的过程。自噬可能在低氧环境下清除缺氧诱导因子1(HIF-1)进而抑制EMT相关基因转录,抑制TGF-β/Smad信号通路从而抑制EMT,通过选择性自噬适配器p62对泛素化蛋白的作用调节EMT转录因子抑制EMT。对自噬与EMT关系的深入研究有助于找到肿瘤治疗的新靶点。

摘要：目的观察特异性阻断hedgehog（Hh）信号通路对胰腺癌Panc一1细胞上皮间质转化（EMT）过程的影响，探讨其分子机制。方法设计并合成针对Smoothened（SMO）基因特异性的RNA干扰靶点，运用慢病毒介导的RNA干扰技术沉默SMO基因表达以阻断人胰腺癌Panc-1细胞Hh信号通路。应用Matrigel／Transwell法检测阻断Hh信号通路后胰腺癌细胞侵袭能力的变化，应用实时PCR及Western印迹方法检测阻断Hh通路后Panc一1细胞EMT标志物E—cadhefin、N—cadhefin、***、Vimentin、Fibronectin等的表达变化；并检测EMT调控因子Snail、Slug等的表达变化。结果稳定干扰SMO基因表达阻断Hh信号通路后，人胰腺癌Panc-1细胞侵袭能力明显降低，P=0．020；上皮表型标志物***表达明显上调，而间质表型Vimentin、Fibronectin、N—cadhenn等的表达水平显著下调，P值分别为0．020、0．001、0．031和0．022；与对照组相比，SMO干扰组细胞中转录因子Snail、Slug的表达水平均显著下调，P值分别为0．018和0．016。结论应用慢病毒介导的RNA干扰技术特异性沉默SMO基因阻断人胰腺癌细胞中Hh通路活性，可显著抑制Panc-1细胞EMT过程，其机制与下调转录因子Snail及Slug表达有关。

摘要：目的探究性别决定区Y框蛋白9(SOX9)对人口腔鳞状细胞癌(OSCC)CAL27微管形成和上皮间质转化的影响及其作用机制。方法设计合成SOX9-shRNA1和SOX9-shRNA2,将SOX9-shRNA1和SOX9-shRNA2转染到CAL27细胞中,实时荧光定量聚合酶链反应检测SOX9的表达水平;微管形成实验检测微管结节数目的变化;免疫荧光检测波形蛋白(Vimentin)的含量;免疫印迹法检测钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)、纤连蛋白(Fibronectin)、Wnt、β-连环蛋白(β-catenin)和T细胞4(TCF-4)蛋白的相对表达量。结果SOX9-shRNA1和SOX9-shRNA2转染CAL27细胞后,SOX9的表达水平显著降低(F=578.000,P=0.000;F=96.850,P=0.000)。干扰SOX9后可抑制OSCC细胞上皮间质转化。干扰SOX9后微管结节数目和Vimentin阳性细胞数显著减少(F=169.700,P=0.000);E-cadherin蛋白表达水平显著升高(F=181.400,P=0.000);N-cadherin、Fibronectin、Wnt、β-catenin、TCF-4蛋白表达水平显著降低(N-cadherin:F=101.400,P=0.000;Fibronectin:F=122.300,P=0.000;Wnt:F=70.290,P=0.000;β-catenin:F=81.740,P=0.000;TCF-4:F=37.020,P=0.000)。结论干扰SOX9降低Vimentin的含量,抑制微管形成,影响上皮间质转化标记分子的蛋白表达以及抑制Wnt/β-catenin通路的激活,结果表明SOX9可诱导人OSCC细胞CAL27微管形成和上皮间质转化,这一作用与Wnt/β-catenin通路激活抑制存在关联。

摘要：目的探讨青蒿素联合顺铂对胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡及上皮间质转化(EMT)的影响。方法采用青蒿素(50μmol/L)、顺铂(10 mg/L)单药或联合处理SGC-7901细胞,根据实验设计将SGC-7901细胞分为4组:对照组、青蒿素组、顺铂组和青蒿素+顺铂组,对照组仅加入培养基;采用噻唑蓝(MTT)比色法检测各组SGC-7901细胞经处理24、48、72、96 h的增殖情况并计算增殖抑制率,采用Annexin V/PI双染流式细胞术检测各组处理24、48 h的凋亡率,免疫印迹法检测各组处理48 h后的EMT相关标记分子(E-cadherin、N-cadherin及Vimentin),采用酶联免疫吸附法(ELISA)测各组处理24、48、72及96 h的细胞上清液中纤连蛋白(FN)水平。结果与对照组相比,青蒿素组、顺铂组和青蒿素+顺铂组均可呈时间依赖方式提高增殖抑制率,青蒿素+顺铂组在24、48、72和96 h后的增殖抑制率均高于青蒿素组和顺铂组(P<0.05);3组处理后的早、晚期凋亡率及E-cadherin水平均高于对照组,而N-cadherin、Vimentin水平及上清液FN水平均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);与青蒿素组和顺铂组相比,青蒿素+顺铂组的早、晚期凋亡率及E-cadherin水平较高,N-cadherin和Vimentin水平及上清液FN水平较低,以上差异均有统计学意义(P<0.05)。结论青蒿素和顺铂对胃癌SGC-7901细胞均有细胞毒性,如抑制增殖、诱导凋亡及抑制EMT;同时,青蒿素联合顺铂对胃癌细胞具有协同增效的作用。

摘要：目的探讨去泛素化酶3(deubiquitinating enzyme 3,Dub3)在肝癌细胞增殖、上皮间质转化、迁移和侵袭中的作用以及相关机制。方法设计合成Dub3的干扰序列和对照序列,转染HepG2细胞分别作为siRNA-Control组和siRNA-Dub3组,不进行转染的细胞作为Blank组。蛋白质免疫印迹(WB)和荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测Dub3的表达;MTT试验检测细胞增殖;细胞免疫荧光染色检测细胞中E-cadherin和N-cadherin的表达;WB检测E-cadherin、claudin-1、N-cadherin、vimentin、MMP2、MMP9、snail、slug和twist的表达;Transwell试验检测细胞迁移和侵袭。结果与Blank组和siRNA-Control组相比较,siRNA-Dub3组细胞中Dub3蛋白质和mRNA的表达降低(P<0.05)。与Blank组和siRNA-Control组相比较,siRNA-Dub3组细胞在培养48和72 h时的OD值降低;E-cadherin荧光强度升高,N-cadherin荧光强度降低;E-cadherin和claudin-1表达上升,N-cadherin和vimentin表达降低;MMP2和MMP9的表达降低;迁移和侵袭的细胞数量降低;snail、slug和twist的表达降低(P<0.05)。结论Dub3沉默可以抑制肝癌细胞增殖、上皮间质转化、迁移和侵袭,可能与下调snail、slug和twist表达有关。

摘要：目的:探讨FBW7(F-box/WD repeat-containing protein 7)是否参与转录抑制因子Snail的泛素化修饰,通过调节上皮间质转化(EMT)进而导致非小细胞肺癌的侵袭和转移,为治疗非小细胞肺癌(NSCLC)患者晚期转移提供新的思路。方法:首先,通过Western Blot方法检测多种人肺细胞系中Snail的表达水平。上调(药物处理)及下调(设计并合成特异性sh RNA转染)H460细胞中FBW7的表达后,检测Snail的表达水平。采用平板克隆及Transwell方法检测下调FBW7的H460细胞形态改变和侵袭转移能力变化。结果:人非小细胞肺癌H460细胞中Snail表达水平较高。上调FBW7表达可使Snail表达下降,经蛋白酶抑制剂MG132处理后Snail表达升高;而下调FBW7表达后Snail表达增加。下调FBW7表达细胞后,细胞形态改变,侵袭转移能力增强。结论:FBW7参与了Snail泛素化修饰,进而经蛋白酶体途径将其降解引起EMT,导致肿瘤转移和进展的发生。