摘要：目的探讨Rab25沉默对转化生长因子-β(TGF-β)诱导的前列腺癌LNCaP细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法设计针对Rab25基因的3个干扰靶点(shRab25-1、shRab25-2、shRab25-3),将目的基因片段克隆到慢病毒载体中,连接产物转化到前列腺癌LNCaP细胞后提取重组质粒,分别作为shRab25-1组、shRab25-2组、shRab25-3组,并设置空白对照NC组。采用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)及蛋白质印迹法(Western blot)检测Rab25 mRNA和蛋白相对表达量,筛选高干扰效率靶序列。培养NC组和shRab25-1组细胞,加入TGF-β(5 ng/ml)或不加入TGF-β,分别作为NC组、NC+TGF-β组、shRab25-1组、shRab25-1+TGF-β组,使用相差显微镜观察各组LNCaP细胞的形态学变化,采用Western blot检测各组LNCaP细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达情况。结果测序结果显示成功构建了Rab25的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体。qRT-PCR和Western blot检测结果显示,Rab25沉默后shRab25-1组细胞中Rab25表达量最低。相差显微镜显示Rab25沉默后细胞密度降低,加入TGF-β会部分逆转这种抑制作用,同时各组细胞形态结构未见明显破坏。shRab25-1组细胞中E-cadherin蛋白相对表达量高于NC组,N-cadherin蛋白相对表达量低于NC组,差异均有统计学意义(P﹤0.05);NC+TGF-β组细胞中E-cadherin蛋白相对表达量低于NC组,N-cadherin蛋白相对表达量高于NC组,差异均有统计学意义(P﹤0.05);shRab25-1+TGF-β组细胞中E-cadherin蛋白相对表达量低于shRab25-1组,N-cadherin蛋白相对表达量低于NC+TGF-β组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。结论Rab25沉默可逆转TGF-β介导的前列腺癌LNCaP细胞的EMT。

摘要：目的探讨C1GALT1在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞BGC-823生物学行为的影响。方法采用生物信息学、qRT-PCR和Western blot法分析C1GALT1 mRNA和蛋白在胃癌组织和正常胃黏膜组织、胃癌细胞和正常胃黏膜细胞中的表达,以C1GALT1 cDNA序列为靶点设计siRNA瞬时转染BGC-823细胞,采用Transwell实验检测C1GALT1-siRNA对胃癌BGC-823细胞迁移和侵袭能力的影响。运用Western blot法检测BGC-823细胞在转染C1GALT1-siRNA后上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的表达。结果C1GALT1在胃癌组织和细胞(BGC-823、SGC-7901、MGC-803)中呈高表达(P<0.05);干扰BGC-823细胞中C1GALT1表达后,BGC-823细胞迁移和侵袭能力均下降(P<0.05),上皮细胞标志物E-cadherin和Claudin-1蛋白表达水平均升高,间充质细胞标志物vimentin和Slug蛋白表达水平均下降(P<0.05)。结论C1GALT1在胃癌组织和细胞中高表达,C1GALT1基因沉默后能抑制胃癌细胞BGC-823的迁移和侵袭能力,其机制可能与EMT相关。

摘要：目的观察靶向干扰Twist基因对肝细胞性肝癌Smad3以及上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白表达的影响,探讨Twist通过Smad3信号途径促进肝细胞癌中EMT的发生机制。方法收集山西医科大学第一医院普通外科2018年3月至2019年2月手术切除的肝细胞癌及癌旁组织各30例,免疫组织化学检测肝细胞癌及癌旁组织中Twist、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad3蛋白的表达,分析其表达的相关性。实验分为3组:空白对照组(Control)、随机小干扰RNA(siRNA)组(Mock)及实验组(siRNA-Twist)。设计合成Twist小干扰RNA(siRNA),脂质体2000法转染至HepG2细胞,蛋白质印迹法(Western blot)检测Twist、TGF-β1、Smad3、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达,Transwell实验观察细胞侵袭能力的变化。计数资料采用χ2检验,相关分析采用Spearman相关分析,多组计量资料的比较采用One-way ANOVA,两两比较采用LSD-t检验。结果Twist、TGF-β1、Smad3在肝癌组织中的表达率依次为70.0%、63.3%及33.3%,在癌旁组织中的表达率依次为6.7%、26.7%及73.3%,与癌旁组织比较,Twist及TGF-β1在肝细胞癌组织中表达增高,Smad3表达降低,差异均有统计学意义(Twist:χ2=25.452,P<0.01;TGF-β1:χ2=8.148,P<0.01;Smad3:χ2=9.643,P<0.01)。Twist在肝细胞癌中的表达与TGF-β1呈正相关(r=0.408,P<0.05),与Smad3呈负相关(r=-0.463,P<0.05)。靶向干扰Twist基因可上调HepG2细胞Smad3、E-cadherin蛋白的表达(Smad3:F=25.625,P<0.01;E-cadherin:F=86.858,P<0.01),可下调TGF-β1、Vimentin蛋白的表达(TGF-β1:F=28.271,P<0.01;Vimentin:F=98.412,P<0.01),差异有统计学意义。靶向干扰Twist基因可降低HepG2细胞增殖及侵袭能力。结论Twist通过Smad3信号途径促进肝细胞癌中EMT的发生。

摘要：目的探讨前列腺癌细胞内肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(TNFAIP8)的表达变化对其侵袭与转移能力的影响,及在此过程中有无上皮-间充质转化(EMT)参与。方法设计合成靶向抑制TNFAIP8基因的短发卡RNA(shRNA)慢病毒质粒(shTNFAIP8),转染前列腺癌PC3细胞,分为shTNFAIP8组(转染TNFAIP8 shRNA),空载细胞组(转染对照shRNA)和阴性对照组(未转染),反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测3组TNFAIP8和EMT相关标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和紧密连接蛋白(ZO1) mRNA及蛋白表达水平,通过细胞划痕和Transwell小室侵袭实验检验3组细胞侵袭与转移能力。组间比较采用t检验。结果 shTNFAIP8组Vimentin和N-cadherin mRNA及蛋白表达量(0.51±0.17、0.32±0.11、0.29±0.04、0.25±0.05)明显低于阴性对照组(1.00±0.32、1.00±0.23、0.63±0.10、0.65±0.07,t= 3.024、5.964、7.059、10.401,P<0.05)及空载细胞组(1.00±0.26、1.00±0.26、0.61±0.13、0.63±0.08,t=3.527、5.386、5.261、9.007,P<0.05),而E-cadherin和ZO1 mRNA及蛋白表达量(4.21±1.12、2.70±0.87、0.49±0.07、0.52±0.08)明显高于阴性对照组(1.00±0.14、1.00±0.26、0.31±0.06、0.39±0.05,t= 6.359、4.186、4.679、3.081,P<0.05)及空载细胞组(1.00±0.21、1.00±0.24、0.27±0.05、0.39±0.07,t=6.299、4.212、5.719、2.735,P<0.05),差异有统计学意义。shTNFAIP8组24 h后的划痕愈合百分比[(0.72±0.12)%]高于阴性对照组[(0.52±0.11)%]及空载细胞组[(0.53±0.12)%],差异有统计学意义(t=2.747、2.372,P<0.05)。shTNFAIP8组穿膜细胞数[(52±17)个]少于阴性对照组[(141±34)个]及空载细胞组[(150±45)个],差异有统计学意义(t=5.235、4.555,P<0.05)。结论下调表达TNFAIP8可通过调控EMT抑制前列腺癌细胞的侵袭与转移。

摘要：目的探讨前列腺癌细胞内肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(MYPT1)的表达变化及其对侵袭转移能力的影响。方法设计合成过表达MYPT1基因的慢病毒质粒(pLenti6.3-MYPT1),转染前列腺癌PC3及DU145细胞48 h,设定对照组(转染对照pLenti6.3-Ctrl)和过表达组(转染pLenti6.3-MYPT1);采用细胞划痕和Transwell实验检测24 h及48 h细胞迁移和侵袭能力;免疫荧光(IF)染色检测细胞骨架变化;蛋白质印迹法(Western blot)和定量聚合酶链式反应(qPCR)检测细胞株(PC3、DU145)转染后MYPT1和上皮-间充质转化(EMT)相关分子标志物:N-钙黏蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、锌指结构蛋白(Snail)和E盒结合锌指蛋白1(ZEB-1)的mRNA及蛋白相对表达水平。组间统计分析采用独立样本t检验。结果转染pLenti6.3-MYPT1后,PC3和DU145细胞内MYPT1相对表达水平明显上调,差有统计学意义(Western blot:0.834±0.055、0.849±0.044比0.487±0.026、0.526±0.045,t=8.098,7.212,P<0.01;qPCR:3.134±0.280、2.091±0.099比0.967±0.034、1.019±0.150,t=10.860,8.449,P<0.01)。细胞划痕和Transwell实验显示转染过表达质粒后细胞迁移(t=8.342,6.776,P<0.01)和侵袭(t=11.670,11.870,P<0.001)能力明显减弱。免疫荧光染色表明,与对照组比较,过表达MYPT1的细胞表面变光滑,丝状伪足和片状伪足减少,F-肌动蛋白(F-actin)从细胞质富集到细胞膜,着色变浅。两细胞株过表达组N-cadherin、MMP-2、MMP-9、Snail、ZEB-1显著低于对照组(P<0.05)。结论过表达MYPT1能抑制前列腺癌细胞的迁移侵袭能力,其作用机制可能与细胞骨架重构及EMT相关。

摘要：目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建人整合素连接激酶ILK基因敲除的人骨肉瘤U2OS细胞系,探讨ILK敲除对骨肉瘤细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法首先在人ILK基因的第2,4,6外显子区域选取序列,分别设计3组靶向ILK的sgRNA,退火后与酶切lentiCRISPRv2慢病毒质粒连接,构建含有sgRNA的重组质粒,重组载体与病毒包装质粒共转染293T细胞后获得慢病毒颗粒;将病毒颗粒感染U2OS细胞,经嘌呤霉素筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株,通过测序、qRT-PCR及Western blot鉴定ILK基因稳定敲除细胞系,并进一步通过Western blot检测E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、Snail1、Snail2、Twist等EMT相关标记分子以及Akt的磷酸化水平。结果构建了3组lentiCRISPRv2-ILK-sgRNA敲除质粒,经慢病毒感染U2OS细胞后及单细胞克隆株的筛选鉴定后得到了一株含有ILK等位基因突变的细胞,Western blot证实ILK^(-/-)细胞中ILK蛋白表达缺失;相比野生型,ILK^(-/-)细胞中N-钙黏蛋白、Snail1、Snail2及Twist蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),而E-钙黏蛋白表达则显著升高(P<0.05);与野生型细胞相比,ILK^(-/-)细胞Akt通路的磷酸化水平显著降低(P<0.05),而经TGF-β1处理后,相比野生型细胞,ILK^(-/-)细胞中Akt激活水平亦显著下降(P<0.01)。结论成功构建ILK^(-/-)U2OS细胞系,敲除ILK可能通过下调Akt信号通路抑制U2OS细胞的EMT进程。

摘要：Wdpcp作为平面细胞极性的效应基因,在胚胎时期主要通过影响细胞运动和初级纤毛生长参与多种器官和组织的发生和发育过程。WDPCP突变与临床上Bardet-Biedl综合征和Meckel-Gruber综合征相关。该文主要揭示了Wdpcp基因调节小鼠冠状动脉发育的新功能和机制,丰富了该基因的致病类型,为临床上诊断冠状动脉疾病的发病原因提供了重要的遗传学依据。

摘要：目的:探讨沙利霉素对口腔舌鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,并初步分析其影响机制。方法:CCK8法检测沙利霉素和顺铂分别作用于CAL-27细胞和***926细胞后,对细胞增殖的影响;Transwell小室法检测沙利霉素对CAL-27细胞侵袭和迁移能力的作用;Western免疫印迹检测沙利霉素对CAL-27细胞中E钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和β连环蛋白(β-catenin)表达的影响。采用SPSS20.0软件包对数据进行统计学分析。结果:沙利霉素抑制CAL-27细胞的增殖,呈时间、剂量依赖性,且其增殖抑制作用强于顺铂(P<0.05);经过沙利霉素(4μmol/L)处理过的CAL-27细胞,其侵袭和迁移能力均显著低于空白对照组(P<0.05);沙利霉素上调CAL-27细胞中E-cadherin蛋白的表达水平,并且下调vimentin和β-catenin蛋白的表达水平。结论 :沙利霉素能够明显抑制CAL-27细胞的增殖能力,显著减弱CAL-27细胞的侵袭和迁移能力,其机制可能与抑制癌细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)有关。

摘要：目的探讨溶酶体组织蛋白酶L(Cathepsin L)是否通过上皮-间充质转化(EMT)影响卵巢癌细胞的侵袭及迁移能力。方法荧光定量PCR法检测人卵巢癌细胞ES-2、SKOV3、OV1以及OV2中Cathepsin L的表达水平;设计并合成靶向Cathepsin L的特异性sh RNA,通过脂质体转染法转染Cathepsin L表达最高的卵巢癌细胞SKOV3以构建稳定低表达Cathepsin L细胞株,Western blot和定量PCR法验证sh RNA的干扰效率;划痕实验及Transwell法检测干扰后细胞的迁移及侵袭能力,Western blot法检测EMT相关指标E-cadherin和N-cadherin以及其上游信号分子Snail、p-AKT的变化。结果四株卵巢癌细胞中,SKOV3的Cathepsin L表达水平最高(以此为参照),而ES-2、OV1以及OV2细胞的表达水平分别为0.72±0.04、0.34±0.03和0.55±0.05。Cathepsin L-sh RNA转染SKOV3细胞后,SKOV3/sh RNA中的Cathepsin L的表达水平较空白组和对照组显著下降;划痕12 h和24 h后,SKOV3/sh RNA组的细胞迁移能力明显受到抑制;SKOV3、SKOV3/Con和SKOV3/sh RNA组的穿膜细胞数分别为(93.67±8.62)、(90.33±12.22)、(35.67±4.73),与对照组相比,SKOV3/sh RNA组细胞侵袭能力受到显著抑制(P<0.01);Cathepsin L干扰组细胞的E-cadherin表达增加,N-cadherin的表达降低;此外,Cathepsin L干扰组细胞的Snail、p-AKT表达较对照组显著下降。结论 Cathepsin L可以促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭;其机制可能与调节EMT的上游信号分子Snail、p-AKT有关。提示Cathepsin L在卵巢癌的发生发展中起重要作用。

摘要：目的探讨溶酶体组织蛋白酶L(Cathepsin L)是否通过上皮-间充质转化(EMT)影响宫颈癌细胞的侵袭及迁移能力。方法利用荧光定量PCR来检测人宫颈癌细胞HeLa、CaS ki以及HeLa229中Cathepsin L的表达水平;设计并合成靶向Cathepsin L的特异性shRNA,通过脂质体转染法转染Cathepsin L表达最高的宫颈癌细胞HeLa以构建稳定低表达Cathepsin L细胞株,通过Western blot和定量PCR来验证shRNA的干扰效率,拟将Cathepsin L-shRNA和空白对照载体转染HeLa细胞,并将构建好的稳定细胞株命名为HeL a/shRNA,空白组和对照组分别为HeLa和HeLa/Con。通过Transwell法检测干扰后细胞的迁移及侵袭能力,Western blot法检测EMT相关指标E-cadherin和N-cadherin以及其上游信号分子Snail、WNT-5a的变化。结果 Cathepsin L-shRNA转染后,能够有效抑制HeLa细胞中Cathepsin L的表达;Transwell法检测结果显示,Cathepsin L干扰组细胞侵袭及迁移能力显著低于阴性对照组(P<0.001)。Western blot法检测结果发现,Cathepsin L干扰组细胞的E-cadherin表达增加,N-cadherin的表达降低;此外,Cathepsin L干扰组细胞的Snail、WNT-5a表达较对照组显著下降。结论运用RNA干扰技术能够有效沉默HeLa细胞的Cathepsin L基因,并诱导其迁移侵袭能力的下降,其可能的机制是通过调节EMT的上游信号分子Snail、WNT-5a的表达来调控EMT,从而影响宫颈癌细胞的迁移及侵袭。提示Cathepsin L在宫颈癌的发生发展中起重要作用,抑制Cathepsin L的表达可能成为一种治疗宫颈癌的新方法。