摘要：采用刚体结构比较法进行蛋白质的结构比较，根据结构比较分数构建分子进化树， 研究丝氨酸蛋白酶超家族分子的进化规律。对分子进化树进行了一些初步分析，得到了一些有意义的结果。根据蛋白质的进化，可以比较精确的确定某物种的进化地位，对于物种的分类具有重要意义。通过对超家族分子进化的研究可以了解蛋白质超家族不同蛋白质之间的亲缘关系和蛋白质之间的进化差异，对于蛋白质工程分子设计提供帮助。

摘要：丝氨酸蛋白酶与人类生命健康息息相关。人体内丝氨酸蛋白酶水平的异常会引起疾病,危害人类生命安全。丝氨酸蛋白酶荧光探针对于检测体内和体外的丝氨酸蛋白酶数量、活性动态以及临床疾病的治疗有重要意义。因此,重点回顾了近5年来文献中报道的性能优异的常见丝氨酸蛋白酶荧光探针,以各种丝氨酸蛋白酶的显色标记为出发点,总结了目前丝氨酸蛋白酶的荧光探针的合成和性能研究,旨在为丝氨酸蛋白酶的荧光探针设计策略与检测应用提供理论参考。

摘要：从一株具有极强的降解羽毛能力的弗氏链霉菌菌株(Streptomycesfradiaevar.k11)中纯化得到了一种丝氨酸蛋白酶SFP2。经蛋白测序,得到部分氨基酸序列,设计简并引物,PCR扩增得到部分基因序列,通过构建基因文库,获得了包括信号肽序列在内的完整的基因sfp2(EMBL收录号AJ784940),开放阅读框全长924bp,包括114bp的信号肽编码序列和810bp的酶原编码序列,其中成熟蛋白编码基因长576bp,编码191个氨基酸,理论分子量为19.112kD。酶原编码基因和成熟蛋白编码基因均在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中得到了表达,酶原编码基因表达产物具有正常的生物学活性,证明了克隆基因的生物学功能。

摘要：根据已报道的鱼源嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶基因序列设计和合成了 1对可扩增目的片段长度为 893bp的引物 ,建立了检测嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶基因 PCR方法。脱脂奶平板产溶蛋白圈的 10株鱼源嗜水气单胞菌株以及 ATCC796 6检测均为阳性 ,检测的灵敏度可达 2 .0× 10 - 3g/ L的模板 DNA。表明 PCR法在分子水平快速。

摘要：目的　为了寻找新的预防日本血吸虫病的候选疫苗分子。方法　设计合成引物 ,以日本血吸虫成虫基因组DNA为模板 ,用PCR法扩增出丝氨酸蛋白酶 (Sp)基因编码序列 ,其大小约 45 0bp ,将其克隆入pGEM T载体 ,进行序列测定 ,并将Sp基因克隆入真核表达载体 pBKCMV中。 结果　PCR法扩增出SjSp基因编码序列 ,其大小约 45 0bp ,重组质粒 pGEM T Sp和 pBK Sp经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增 ,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段 ,序列测定结果表明具有一个长度为 42 7bp的不完整开放阅读框 ,其与曼氏血吸虫丝氨酸蛋白酶 (SmSp1)具有高度同源性。 结论　本文首次报道了日本积压吸虫丝氨酸蛋白酶 (SjSp)的部分基因编码序列 ,并克隆入了真核表达载体 pBKCMV中 ,为进一步研究提供了条件。

摘要：蛋白质工程就它的涵义来说,就是把天然蛋白质分子的一部分加以变更或改造,甚或从头设计、创造自然界中不存在的全新蛋白质分子,使之适合于功能上某一特定的目的。从技术上说,蛋白质工程应用基因工程的DNA重组技术,把克隆了的基因的DNA编码序列加以改变,或者人工合成新的基因。

摘要：纤细齿梗孢Olpitrichum tenellum是一种寄生在轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides上的活体营养菌寄生真菌。丝氨酸蛋白酶在菌寄生过程可能起到重要作用。根据丝状真菌丝氨酸蛋白酶的同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及RACE的方法,克隆得到1845bp的全长cDNA片段。其可读框为1554bp(GenBank登录号为EU368754),编码517个氨基酸的蛋白质。比对分析发现该蛋白是一种分泌型的丝氨酸蛋白酶,属于丝氨酸蛋白酶S8家族的枯草杆菌蛋白酶subtilisin,具有典型的信号肽-前肽-成熟肽的结构。将该基因可读框除去信号肽插入酵母表达载体pPIC9K,转化毕赤酵母Pichia pastoris GS115,在甲醇诱导下成功分泌出具有生物活性的重组蛋白酶,诱导120h后酶活性可达153U/ml。重组蛋白酶经DEAE-Sepharose层析进行纯化,SDS-PAGE分析其分子量为39kD。其反应的最适温度为60℃,最适pH为8。

摘要：目的克隆斯氏按蚊丝氨酸蛋白酶基因,分析该分子与约氏疟原虫卵囊黑化关系。方法根据其它昆虫丝氨酸蛋白酶的保守氨基酸序列设计简并引物,以斯氏按蚊全蚊cDNA为模板,进行RT-PCR扩增,PCR产物纯化,克隆入pUCm(T载体,测定插入片段序列,对序列进行BLAST检索和鉴定,根据序列设计相应基因的特异引物,然后分别从血淋巴细胞或中肠扩增目的基因,并进行不同食源条件下丝氨酸蛋白酶基因的半定量、原位核酸分子杂交定位与约氏疟原虫卵囊黑化关系的分析。结果获得了2种斯氏按蚊血细胞丝氨酸蛋白酶cDNA部分序列,即AsSP1(448bp)和AsSP2(472bp),分别与冈比亚按蚊SP2A和大劣按蚊SP2基因很相似,其编码的氨基酸序列均包含保守的丝氨酸蛋白酶催化功能域。在中肠和血淋巴内也获得相同的目的基因片段,半定量分析显示约氏疟原虫感染或诱导卵囊黑化呈现之前的表达明显增强,原位核酸分子杂交技术也进一步证实血细胞有AsSP1和AsSP2 mRNA表达。结论AsSP1和AsSP2很可能与疟原虫感染或约氏疟原虫卵囊黑化相关,推测可能是斯氏按蚊的前酚氧化酶的活化酶。

摘要：目的　克隆、表达大劣按蚊丝氨酸蛋白酶。方法　根据已报道昆虫的前酚氧化酶激活酶 (prophenoloxidase -acti vatingenzyme,PPAE)的保守氨基酸序列设计简并引物 ,以大劣按蚊血细胞mRNA为模板 ,进行RT -PCR扩增 ,克隆和测定插入片段 ;所得序列进行BLAST查询 ,并原核表达其中的两种PPAE样丝氨酸蛋白酶cDNA ,通过SDS -PAGE和Westernblotting检测表达产物。结果和结论　获得了 3种大劣按蚊血细胞丝氨酸蛋白酶cDNA部分序列 ,即AdsP1(5 12bp) ,AdsP2(488bp)和AdsP3(5 12bp)。AdsP1和AdsP3与冈比亚按蚊sP14D1、sP14D2、3种昆虫PPAE和黑腹果蝇Easter很相似 ,推测AdsP1和AdsP3可能是大劣按蚊的PPAE ,起调节大劣按蚊黑化包裹约氏疟原虫反应的作用。另外 ,成功表达了AdsP1和Ad sP3部分cDNA序列。

摘要：丝氨酸蛋白酶是丙型肝炎病毒重要的功能蛋白和药物作用靶点,其通过分子内(cis)和分子间(trans)方式催化水解前体蛋白,释放病毒功能蛋白。目的:为深入研究病毒蛋白酶活性和抑制剂鉴定需要,实验研究参照丙型肝炎病毒1a亚型菌株蛋白酶天然底物的氨基酸序列特点,设计了一段包含两个天然底物酶切位点的小分子多肽2S,并进行了原核表达。方法:利用PCR方法,合成2S小分子多肽基因,目的基因两端引入BamHI和EcoRI两个限制性酶切位点,双酶切后将基因与表达载体pGEX-4T-2重组,转化大肠杆菌DH5α,经化学诱导进行GST融合蛋白表达,通过亲和层析柱纯化目的蛋白。纯化的GST-2S融合蛋白在体外反应系统进行酶切鉴定,SDS-PAGE和ELISA鉴定酶切结果。结果:PCR合成的小分子底物多肽2S基因,经与表达载体重组后测序,证实基因序列正确。采用0.5mmol/L浓度的IPTG诱导工程菌过夜,获得表达的目的蛋白,经分离纯化得到融合蛋白GST-2S。GST-2S在体外磷酸盐缓冲系统中与丝氨酸蛋白酶反应,15%SDS-PAGE鉴定酶切产物,证实融合蛋白底物条带明显消失,ELISA结果同样说明融合蛋白的底物活性。结论:含有两个天然底物酶切位点的小分子多肽可以替代病毒天然底物,实验结果为丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶活性研究和酶抑制剂研究奠定了方法学基础。