摘要：为了获得具有免疫原性的猪流行性腹泻病毒(PEDV)主要中和抗原表位(COE)蛋白及其多克隆抗体,试验对已发表的PEDV基因序列进行比对,并设计、合成COE编码基因(420 bp),将其克隆入原核表达载体pET-30a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达,利用胶体金和Western-blot方法检测表达产物;纯化后免疫兔制备高免血清,并利用ELISA方法检测血清抗体效价。结果表明:表达的重组蛋白可与PEDV特异性抗体结合;免疫兔后获得的血清抗体效价达1∶6 400,具有免疫原性。

摘要：为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的C末端(CPAC)与中和抗原表位NE(ARGFAK)的串联融合蛋白并评价其免疫原性,对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC及NE的编码基因进行优化设计,并将两个基因的三拷贝序列串联,经人工合成获得基因片段GCPAC3NE3。将该片段克隆至原核表达载体p ET30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白。利用Western blot方法检测重组蛋白与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,以纯化的重组蛋白免疫家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测家兔血清的中和抗体效价。在二免后21 d,以1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素对家兔进行攻毒。结果表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免抗血清可中和40个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和80个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,重组蛋白具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。

摘要：以玉米为生物反应器,将猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)主要中和抗原表位(core neutralizing epitope,COE)基因导入玉米自交系,获得了高效表达PEDV-COE的转基因玉米稳定株系。首先,根据玉米密码子的偏好性,设计合成优化的COE编码基因,构建了植物表达载体p BAC9036。然后,利用PDS1000/He基因枪转化玉米幼胚,经过愈伤组织诱导、分化再生培养,获得71株转化再生植株,进而通过田间草甘膦抗性筛选,获得2个T1代转基因玉米稳定株系。通过PCR、RT-PCR、间接ELISA和Western blot等鉴定结果显示,COE基因已成功整合到玉米基因组并进行了转录和蛋白表达。并且种子中COE蛋白占可溶性总蛋白的0.122%和0.078%。最后,提取转基因玉米稳定株系的种子可溶性蛋白,与佐剂混合皮下注射免疫小鼠并取可溶性蛋白灌胃免疫小鼠,均可产生针对PEDV抗原的特异性抗体。获得的转基因玉米可有效表达COE蛋白,表达产物具有显著的免疫原性,为进一步研制PEDV-COE转基因玉米疫苗奠定了基础。

摘要：目的:构建肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)的线性中和抗原表位与诺如病毒P结构域融合基因的重组质粒,在大肠杆菌中表达诺如病毒P结构域与EV71中和抗原表位的嵌合蛋白。方法:根据已报道的3个EV71线性中和抗原表位的氨基酸序列,按大肠杆菌密码子表达使用的偏好性优化和设计各线性中和抗原表位的核苷酸序列,将这些表位以单个或不同的组合克隆至含诺如病毒P结构域和GST标签的质粒中,经测序确认后,分别转化到*** BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG诱导融合蛋白表达。用GST融合蛋白纯化磁珠对融合蛋白进行纯化,最后通过免疫印迹法确认融合蛋白的表达及嵌合蛋白的抗原性。结果:测序结果表明,成功地构建了含EV71病毒3个单表位和4个串联中和抗原表位的诺如病毒P结构域重组质粒,而且这7个含线性中和抗原表位的嵌合蛋白在大肠杆菌中都以可溶形式得到了表达。免疫印迹分析表达蛋白的抗原性结果表明,表达的嵌合蛋白都能与抗诺如病毒P结构域抗血清反应。除了含单表位的SP55和SP28嵌合蛋白外,其它的嵌合蛋白均能与抗EV71病毒的抗血清反应。结论:成功地在大肠杆菌中表达了诺如病毒P结构域和EV71病毒中和抗原表位的嵌合蛋白,且具有抗原性,这为诺如病毒和EV71病毒的二价疫苗及检测方法的研发奠定了基础。

摘要：合成肽疫苗能克服常规疫苗的缺点,很早就被认为是动物传染病预防用的终极疫苗。然而多年的研究结果表明,合成肽疫苗免疫动物后所起的免疫保护作用并没有象人们当初设想的那样理想,同时证明了构建的合成肽疫苗的抗原性及其免疫原性要受到其自身组成及宿主免疫系统等多种因素的影响。在诱导机体产生免疫的过程中,单一的中和抗原表位是远远不够的,增加中和抗原表位的数目和引入细胞抗原表位将起到必不可少的辅助协同作用。若想提高合成肽疫苗的免疫效果,在搞清合成肽疫苗的免疫机理并在如何利用有限的抗原表位诱导强有力的免疫保护作用等方面需要做进一步深入地研究。