摘要：目的在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)中表达改造后的骨形态发生蛋白10(bone morphogenetic protein 10,BMP10)全长基因,纯化后检测其生物活性,以期获得具有生物活性的BMP10分子。方法于rh BMP10的propeptide与mature chain基因片段之间插入6×his-tag标签及DDDDK(肠激酶识别位点),构建p MH3-rh BMP10-histag-DDDDK质粒,电转入CHO细胞,用500μg/ml G418从单克隆中筛选出稳定表达目的蛋白的重组细胞,悬浮驯化表达8 d后,收集培养液上清,阴离子交换柱和镍柱纯化目的蛋白。采用q-PCR法检测纯化蛋白的体外细胞活性。结果目的蛋白纯化液经SDS-PAGE检测到的条带相对分子质量与目的蛋白理论值相符,Western blot分析可见相对分子质量约48 000、96 000和190 000的3个条带,与目的蛋白单体及多聚体相对分子质量一致。酶切后的目的蛋白可有效刺激P19细胞的标志蛋白(Smad6)表达上调。结论 BMP10 propeptide的存在对BMP10的蛋白活性具有重要作用,改造后的BMP10在CHO细胞中表达具有一定的生物活性。本研究为全长BMP10活性二聚体的制备提供了新的思路。

摘要：目的 :分别构建人透明带蛋白(zona pellucida, ZP)基因ZP1、ZP2、ZP3、ZP4与荧光蛋白基因的融合蛋白表达载体,并在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞和卵母细胞中表达这些荧光标记的重组融合蛋白。方法:设计合适的PCR引物,采用GeneArt Gibson Assembly克隆技术,将荧光蛋白基因与人透明带基因形成融合基因片段,用特定的双酶分别酶切中间载体pENTR1A(no ccdB)和融合基因片段后,用T4 DNA连接酶将融合基因片段连入中间载体,再通过Gateway克隆技术将中间载体上的融合基因转入表达载体pInducer20,并对产物进行DNA测序。验证融合基因构建成功后,将含透明带融合基因的质粒进行转化,筛选阳性克隆并扩增、抽提质粒。用脂质体转染法将含融合基因的表达载体转染入CHO细胞,采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测透明带融合基因mRNA的表达,用蛋白印迹法检测透明带融合蛋白的表达,并在激光共聚焦显微镜下观察透明带融合蛋白在CHO细胞内的表达及分布。结果:成功构建所需载体并转染CHO细胞;经RTPCR检测证实人透明带ZP1、ZP2、ZP3、ZP4 mRNA在CHO细胞中表达;经蛋白印迹法检测证实CHO细胞中有重组融合蛋白质的表达;在激光共聚焦显微镜下观察到重组融合蛋白在CHO细胞内表达和定位。结论:本研究成功构建了人类透明带4个基因的荧光融合蛋白表达质粒,以此为实验工具,今后可用于诊断卵子异常导致不孕的病因机制研究。

摘要：目的 构建家蝇幼虫抗菌肽的真核表达载体,并检测它在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达情况.方法 以pUCm-T/Defensin为模板,设计带His标签特异引物,扩增C-末端融合6×His标签的Defensin基因的cDNA全长编码区序列,将其克隆至pcDNA3.1（＋）真核表达载体.经酶切及测序鉴定后,以阳离子脂质体Lipofect AmineTM 2000转染CHO细胞,G418抗性筛选稳定转染的阳性克隆细胞,以RT-PCR分析其mRNA的转录情况,通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以Western免疫印迹鉴定蛋白质表达情况.结果 构建了pcDNA3.1 （＋）-Defensin-His表达质粒,建立了稳定转染的CHO细胞系.RT- PCR从阳性克隆CHO细胞系中扩增出320 bp大小的目的片段,从转录水平证实pcDNA3.1（＋）-Defensin-His重组细胞株表达了Defensin基因.Western免疫印迹检测可见相对分子质量为10000的阳性条带,表明Defensin-His在该细胞系中成功表达.结论 成功构建了质粒pcDNA3.1（＋）-Defensin-His,并获得了稳定表达的CHO-Defensin细胞株,有利于进一步研究家蝇幼虫抗菌肽Defensin基因的生物学功能.

摘要：帕利珠单抗(Synagis)是用于预防呼吸道合胞病毒的经典药物,但由于价格昂贵,限制了其应用范围。该研究采用中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达帕利珠单抗类似药,并以响应面设计法对培养关键参数进行优化,筛选培养基组合以提高产量。研究结果显示,优化工艺参数为以AM01-AF02为基础-补料培养基,每1 mL含5.0×10^(6)个细胞的密度接种,37℃培养7d后,降温至33.0℃,培养至d16。该工艺条件下,可将帕利珠单抗类似药的产量在摇瓶和3L生物反应器中分别提升69.3%和30.0%。随后,对生物反应器上发酵生产的抗体进行了纯化工艺研究,为帕利珠单抗类似药的后续工艺开发提供了参考。

摘要：中国仓鼠卵巢细胞(CHO)流加培养生产单克隆抗体是目前主流培养方式,其中环境参数(pH和温度)和营养成分均影响细胞生长、碳氮源代谢和外源蛋白表达,是培养过程中关键的控制参数。采用实验设计(design of experiment,DOE)方法研究培养参数(温度、pH)对CHO细胞生长和抗CD20抗体表达的影响,建立营养限制型氨基酸流加策略,实现抗CD20抗体的高表达。结果表明,温度是影响蛋白质表达的显著因素,35℃有助于提高细胞密度和目标抗CD20抗体表达,而pH对抗CD20表达影响不显著,且温度和pH无交互作用,经DOE预测分析最佳培养条件是温度35℃和pH7.0。在该最佳培养条件下,在培养后期酪氨酸和半胱氨酸的浓度都低于0.1mmol/L。在培养的第2天通过补加1.5mmol/L酪氨酸和1mmol/L半胱氨酸避免营养限制,抗CD20抗体表达水平提高了24.1%,且对蛋白糖型无影响。

摘要：中国仓鼠卵巢(Chinese hamsters ovary,CHO)细胞是目前重组蛋白质生产的首选宿主细胞。利用CHO细胞生产重组蛋白质,启动子是启动转基因转录的关键。核心启动子是RNA聚合酶与转录起始复合物集合的部位,分为集中型和分散型两种类型。目前,CHO细胞常用的启动子为病毒启动子、异源启动子、内源性和诱导性启动子等。也可以利用合成生物学及相关的数据库,人工设计合成启动子及鉴定新型启动子。本文综述了CHO细胞常用的启动子以及人工设计的合成启动子在CHO细胞中重组蛋白质表达方面的进展,为哺乳动物细胞选择合适的启动子,保证蛋白质表达量最大化,并确保长时间表达稳定性提供参考。

摘要：中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是目前生产治疗性抗体的主要表达系统,该细胞的培养和抗体表达与培养条件密切相关。本实验室构建出了一种靶向VEGFR2单抗融合MICA的融合蛋白,具有良好的抗肿瘤活性,但是抗体产量较低,限制了该抗体的进一步研发和应用。为了探究适合该抗体的最佳发酵体系,本研究通过Minitab16.0正交法设计多种流加培养方式,探索了4种培养基、流加物以及培养条件对发酵细胞密度和抗体产量的影响,并优化出最佳的发酵方式,即以1×106cells/mL接种密度将细胞接种于商业培养基CDM4PerM Ab,每2 d加入12%(V/V)的流加物Boost2+Boost5。为保持抗体的稳定性和质量一致性,将此发酵方式扩大至3 L发酵罐以提高抗体的批次产量。最终抗体产量可达54.45 mg/L,并且Western blot实验结果验证了融合抗体装配的正确性。MTT实验结果表明JZB01能有效抑制HUVEC、MDA-MB-231和K562的细胞增殖,具有显著的抗血管生成作用以及比母体单抗更有效的抗肿瘤活性。综上,本研究开发出了一种有利于抗体生产的发酵工艺,能够满足实验室抗体研发需求。本实验室将进一步扩大该工艺适用的发酵规模,以满足抗体的临床前研究以及后续工业化生产。

摘要：本研究采用多因素试验设计结合响应面分析法,通过对初始活细胞密度、变温时活细胞密度、培养时间、基础培养基混合比例和五水合硫酸铜添加浓度的研究,优化了以中国仓鼠卵巢细胞培养重组贝伐珠单抗的细胞培养工艺。采用全因子试验设计和中心复合设计,以抗体产量和乳酸浓度作为响应值进行模型拟合,应用MODDE软件对工艺参数模型进行预测,并对最佳工艺参数进行验证,得到的最优工艺参数为:初始时每1 ml含活细胞数(0.9±0.1)×10~6个、变温时每1 ml含活细胞数(20±2)×10~6个、BM01基础培养基占比75%、五水合硫酸铜浓度140μg/L、培养时间14 d,最终抗体产量高达5.3 g/L,同时收获时乳酸水平显著降低至0.4 g/L,降低了工艺失败的风险,提高了培养过程的耐受性。本研究为日后同类细胞培养工艺的开发或研究提供了参考。

摘要：目的在悬浮CHO-S细胞中稳定表达重组人骨形态发生蛋白7(recombinant human bone morphgenetic protein7,rhBMP7)成熟蛋白。方法应用RT-PCR技术从BALB/c乳鼠股骨组织扩增mbmp7基因,克隆至质粒pMD18-T,通过定点突变3个氨基酸编码序列(G266S、S287N、D359E),得到重组克隆质粒pMD18-mbmp7m3;将mbmp7m3克隆至表达载体pCHO1.0,构建重组表达质粒pCHO-mbmp7m3,转染CHO-S细胞,利用嘌呤霉素和甲氨蝶呤进行两轮加压筛选,有限稀释法筛选单克隆细胞,ELISA法检测rhBMP7成熟蛋白的表达。结果从乳鼠股骨组织扩增的cDNA经测序与GenBank中登录的序列完全一致,点突变后测序与设计完全一致。获得了稳定表达rhBMP7成熟蛋白的单克隆细胞株,最高表达量为202 ng/mL。结论成功利用改造的mbmp7基因在CHO-S细胞中表达了rhBMP7成熟蛋白,为后续该制品工艺开发及产业化奠定了基础。

摘要：通过对抗体高产(HP)、低产(LP)2个细胞培养过程进行研究发现,2个过程中脂类代谢差异明显。结果表明,HP中脂类干质量远大于LP过程,且其增速也较快,HP中最大脂类干质量达到(83.70±0.04)×10-9mg/cell,是LP的2.35倍;进一步通过细胞磷脂尼罗红荧光染色检测细胞磷脂含量发现,HP、LP细胞培养过程中细胞磷脂差异显著;随后对3种重要磷脂——磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)的合成前体A(氯化胆碱)、B(乙醇胺)、C(丝氨酸)、D(胞苷)4种因子通过2水平全析因试验设计进行分析,发现组分A对细胞生长、抗体表达影响极显著(P<0.01);最后通过正交试验对培养基中组分A进行浓度优化,以找出基础培养基和流加培养基中组分A的最适浓度。结果发现,基础培养基中组分A最优浓度为95.38 mg/L,流加培养基中最优浓度为189 mg/L;最终活细胞密度对时间累积积分(IVCC)达到79.16×109cells·d/L,提高了74.29%;抗体产量为2.04 g/L,增加了1.83倍;抗体比生成速率为34.07 mg/(109cells·d),提高了18.71%。基于脂类代谢分析,建立了高效经济的细胞培养过程,并为培养基的优化提供了依据,可为后续大规模单克隆抗体工业化生产奠定基础。