摘要：目的 建立一种高效、快速、准确地同步检测侵染三七Panax notoginseng的2种病毒——三七Y病毒(Panax notoginseng virus Y,Pn VY)和中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)的双重PCR技术。方法 分别以单一感染Pn VY或TYLCCNV及复合侵染了这2种病毒的染病三七植株为样品,CTAB法提取叶片总核酸作为模板,根据Gen Bank上已登录的Pn VY和TYLCCNV这2种病毒核酸序列设计特异性检测引物。通过单一PCR技术明确染病三七样品Pn VY和TYLCCNV的发生情况,筛选出可用于一步法双重PCR检测Pn VY和TYLCCNV的引物组合及引物浓度,并对反应条件进行优化。对扩增产物进行克隆测序,验证一步法双重PCR检测的准确性和特异性。结果 建立的一步法双重PCR检测技术能同步有效地检测三七病样中的Pn VY和TYLCCNV,检测灵敏度高,最低检测限点为核酸原液的0.01稀释倍数,特异性强。结论 所建立的一步法双重PCR检测技术可以高效、快速、准确、特异地同步检测三七样品中的Pn VY、TYLCCNV 2种病毒。

摘要：[目的]明确广西西部地区靖西(JX)、凌云(LY)、德保(DB)和乐业(LeY)等4个县市烟草曲叶病的病原。[方法]2010年5-6月分别从广西靖西、凌云、德保和乐业等县市采集具有典型曲叶症状的烟草叶片,用基于双生病毒DNA保守序列设计简并引物Bego-1和Bego-6对病叶组织总DNA抽提物进行PCR扩增和对PCR产物进行序列测定,用BLAST、Vector NTI、MEGA 4.0和Simplot program 3.2软件等进行病毒序列分析、系统进化树构建和病毒重组分析。[结果]从选取的9个表现典型曲叶症状的样品叶组织总DNA抽提物中均可扩增出约1500bp与预期大小相符的DNA片段。测序和序列比对分析显示,9个样品扩增产物核苷酸序列相似性为73.7%～99.2%,与已报道的双生病毒具较高的相似性。其中,JX-2与中国番茄曲叶病毒广西番茄分离物(G32)的相似性最高,达99.2%;JX-3和JX-5与云南胡椒曲叶病毒云南辣椒分离物(YN323)相似性最高,分别为92.5%和93.4%;LeY-1、LY-1、DB-1、JX-1、JX-4和JX-6则与中国番茄黄化曲叶病毒中国番茄分离物(CHI)和广西烟草分离物(G102)的相似性最高,均高于95.0%。基于PCR扩增产物及已报道的双生病毒属代表种相应核苷酸序列构建的系统进化树分析表明,9个广西烟草分离物分属3个簇群:中国番茄曲叶病毒簇、云南辣椒曲叶病毒簇和中国番茄黄化曲叶病毒簇。重组分析结果表明:JX-3是云南辣椒曲叶病毒和中国番茄曲叶病毒的重组病毒,JX-5是云南辣椒曲叶病毒和中国番茄黄化曲叶病毒的重组病毒。[结论]9个广西烟草分离物分属于4种双生病毒:中国番茄曲叶病毒和中国番茄黄化曲叶病毒,以及分别由上述两种病毒与云南辣椒曲叶病毒重组而来的2种重组病毒。其中,中国番茄曲叶病毒自然侵染烟草、云南辣椒曲叶病毒和中国番茄曲叶病毒及中国番茄黄化曲叶病毒的重组病毒等结果此前均未见报道。