摘要：通过RT-PCR方法在云南中华蜜蜂体内检测中蜂囊状幼虫病毒(CSBV),该病毒主要以AmSBV-YN(GenBank ID:KX819276.1)病毒株的形式存在。为了精确鉴定、快速检测中蜂囊状幼虫病毒,根据AmSBV-YN的CDS保守区域,设计合成特异性引物并建立相对应的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的标准曲线循环域值(C_(t))与标准品模板浓度在2.34×10^(2)~2.34×10^(9)copies/μL间的线性关系良好,相关系数R~2为0.994,斜率为-3.118。该方法与蜜蜂残翅病毒、黑蜂王台病毒、蜜蜂以色列急性麻痹病毒不发生交叉反应,表明该方法特异性强;重复性评价结果显示,批内与批间的变异系数均小于3%。所建立的荧光定量PCR方法对中华蜜蜂样品的检测结果显示,阳性率达90.0%,高于常规PCR方法的检测阳性率73.3%,说明该方法具有良好的适用性。结果表明,该方法可应用于对中蜂囊状幼虫病毒的快速检测,为中蜂囊状幼虫病的及时防控提供了有力的技术支持。

摘要：目的建立中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法。方法参照已发表的中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)基因序列,针对其结构蛋白基因设计1对特异性引物,提取感染CSBV的囊状幼虫RNA,反转录为cDNA,以其为模板,进行PCR扩增,对检测方法进行优化,验证该方法的特异性及敏感性,并对31份临床样品进行检测。结果所建立的CSBVRT-PCR检测方法特异性和敏感性良好,以含CSBV结构蛋白基因的重组质粒为模板,最低可检出10pgDNA。临床症状诊断和电镜观察均为阴性的22份样品经RT-PCR检测,有2份扩增出目的条带。结论已建立了中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法,为CSBV检测、流行病学调查及动物模型的建立奠定了基础。

摘要：目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP1蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法以CSBV LN-QY株RNA为模板,RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,对经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对,获得LN-QY株VP1的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,建立VP1结构蛋白的3D模型,在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域,亲水性,表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP1结构蛋白的空间构象比较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于47-53,139-145,273-284氨基酸区段。结论本研究为CSBV LN-QY株VP1蛋白表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研制奠定了理论基础。

摘要：目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法采用RT-PCR法从感染CSBV的蜜蜂幼虫总RNA中扩增结构蛋白VP3基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒,双酶切鉴定并测序,通过与SBV-KOR、CSBV-UK株VP3基因序列的比对,获得LN-QY株VP3基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列,建立VP3蛋白的3D结构。在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP3结构蛋白的空间构象较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于4个区域:25-50,101-109,112-120,250-268氨基酸区段,其中,可能出现抗原表位的2个区域在100-150和250-300氨基酸区段,应作为抗原表位研究的重点区域。结论预测了CSBV LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位,为CSBVVP3蛋白单克隆抗体的制备以及表位疫苗的设计奠定了理论基础。

摘要：【目的】本研究旨在明确中华蜜蜂Apis cerana cerana热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)与中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的关系。【方法】首先根据NCBI上已公布的中华蜜蜂HSP70的全基因(***122655.1)序列,设计特异性引物,提取3日龄中华蜜蜂幼虫总RNA,通过RT-PCR方法获得HSP70基因,并通过生物信息学软件进行分析;其次将其克隆到原核表达载体pET-32a中,转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达,并制备重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体;最后利用制备多克隆抗体作为一抗,通过Western-blot方法检测CSBV感染中华蜜蜂前后HSP70在幼虫体内的变化。【结果】成功获取中华蜜蜂HSP70蛋白的全基因,其核苷酸序列全长为1833 bp,生物信息学分析后,发现其编码蛋白存在7个抗原表位。利用原核表达系统,成功获得大小约87 ku的重组蛋白HSP70,免疫小鼠后获得多克隆抗体,经Western-blot分析能与标签蛋白发生特异性反应;对感染CSBV前后蜜蜂体内HSP70蛋白检测发现感染后HSP70表达水平显著提高。【结论】通过原核表达系统,成功表达中华蜜蜂HSP70基因和HSP70多克隆抗体,并证实CSBV感染后影响中华蜜蜂体内HSP70蛋白表达量的改变,为深入研究HSP70功能提供了帮助。

摘要：目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP2蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法将已感染CSBV LN-QY株的RNA作为模板,进行RT-PCR扩增该毒株结构蛋白VP2基因,再与pMD18-T载体连接,之后转化大肠杆菌DH5α感受态,对经EcoRⅠ和BamH I双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对,获得LN-QY株VP2的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,建立VP2结构蛋白的3D模型,在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP2结构蛋白的空间构象比较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于178-184,144-199,211-217氨基酸区段。结论本研究为CSBV LN-QY株VP2蛋白表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研制奠定了理论基础。