摘要：目的构建串联表达5个针对大鼠kir2·1基因shRNA的真核表达载体,观察其对该基因表达的影响。方法选择5个针对大鼠kir2·1基因的RNA干扰位点,分别设计合成相应的5对寡核苷酸链,形成双链后分别连入带有U6启动子的相应载体,反复酶切连接将表达5个kir2·1shRNA的目的基因依次连接入载体pEGFP6-1,构建成串联真核表达载体pEGFP6-1Kir2·1,将其转染培养的大鼠心肌细胞,RT-PCR和Western印迹检测其对Kir2·1mRNA转录和蛋白表达的影响。结果成功构建串联表达5个大鼠Kir2·1基因shRNA的真核表达载体,该载体对大鼠心肌细胞Kir2·1mRNA转录的抑制率为83·5%,对心肌细胞Kir2·1蛋白表达的抑制率为68·1%。结论串联表达多个大鼠心肌细胞Kir2·1基因shRNA真核表达载体介导的RNA干扰可以特异性抑制该基因的表达,可能成为制造生物起搏器的一种新方法。

摘要：为克服抗菌肽易被蛋白酶降解及对宿主大肠杆菌的杀伤作用,并进一步提高大肠杆菌系统的表达能力,以棘胸蛙Paa spinosa抗菌肽Spinosan-C为研究对象,按照大肠杆菌密码子利用频率进行密码子优化,设计合成8拷贝的串联8×Spinosan-C基因,将合成的串联基因克隆到大肠杆菌表达载体p ET-28a,利用大肠杆菌感受态细胞Rosetta进行原核表达,获得高效表达的串联8×Spinosan-C重组蛋白,用甲酸专一性切割得到抗菌肽Spinosan-C单体。体外抑菌试验表明,切割后的抗菌肽Spinosan-C单体对测试菌生长具有抑制作用,为蛙类抗菌肽的规模化制备提供了参考。

摘要：为串联融合表达牛瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)p33表面蛋白,本研究根据GenBank中登录的*** p33基因序列(D87198),在去掉信号肽的部分设计两对引物。PCR扩增出两段相同的p33基因(p331、p332),大小均为684bp,并将两个基因片段按顺序依次插入原核表达载体pGEX-4T-1中构建pGEX-p331-p332(2p33)。将pGEX-2p33重组质粒转化*** BL21中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳显示,该融合蛋白获得了高效表达,分子量约为80ku,表达产物以包涵体的形式存在。Western blot试验表明,融合蛋白可被***阳性血清识别,具有较好的反应原性。该蛋白的串联融合表达为***新型疫苗的研究奠定了基础。

摘要：根据GenBank中发表的***88、K99基因序列,分别设计合成1对引物。利用PCR技术,以大肠杆菌C83907和C83644的质粒为模板分别扩增不含信号肽的K88及K99基因。通过分离、纯化、限制性核酸内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88-K99串联表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pETK88CK99)。结果显示,经酶切、PCR鉴定和DNA序列分析,证实了构建的重组质粒pETK88CK99中含有K88K99融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经过SDS-PAGE分析,串联表达蛋白含量占菌体蛋白的40%左右,经Western blotting检测,该串联表达蛋白能被大肠杆菌K88、K99标准血清识别。结果表明,构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基因工程疫苗的候选菌株。

摘要：为探究无乳链球菌菌毛岛屿3个亚基AP1、AP2、BP融合蛋白的抗原性,本研究根据该3个亚基基因的主要抗原结构域序列设计并合成引物,通过重叠延伸PCR技术获得上述3个亚基的串联核苷酸片段,并插入pET-30a(+)载体,转化至BL21(DE3)感受态细胞后诱导表达,表达蛋白经亲和层析纯化后进行western blot鉴定和小鼠免疫实验。结果表明,AP1-AP2-BP融合抗原具有良好的反应原性和免疫原性。本研究为进一步研究无乳链球菌基于AP1-BP-AP2融合蛋白的致病机制、检测制剂及亚单位疫苗研制提供了实验依据。

摘要：为研究牛IL-18基因对瑟氏泰勒虫p33疫苗的免疫佐剂效应,根据GenBank上已经发表的p33基因序列和牛IL-18基因序列(IL-18)设计2对特异性引物,以瑟氏泰勒虫基因组DNA和pMD-19-T-IL-18质粒DNA为模板,采用SOE-PCR技术将2个基因连接在一起,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,获得1 416bp的目的基因IL-18-p33,克隆于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了双基因重组表达载体pGEX-4T-1-IL-18-p33,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出预期大小为79 000的融合蛋白。Western blotting检测结果显示,该蛋白与瑟氏泰勒虫抗血清呈阳性反应,表明融合蛋白具有反应原性,为进一步研究IL-18对瑟氏泰勒虫p33基因疫苗的免疫佐剂效应奠定了基础。

摘要：根据GenBank中发表的*** F41、987P基因序列,分别设计合成一对引物。利用PCR技术,分别以大肠杆菌C83707的基因组和C83710的质粒为模板扩增F41、987P基因。通过分离、纯化、限制性核酸内切酶酶切、连接和转化,构建了含F41-987P串联表达载体的重组菌株BL21(DE3)/pETF41-987P。经酶切、PCR鉴定和DNA序列分析,证实了构建的重组质粒pETF41-987P中含有F41-987P融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经过SDS-PAGE分析,串联表达蛋白含量在30%左右,经Western blot检测,该串联表达蛋白能被大肠杆菌F41、987P阳性血清识别。反向间接血凝试验结果,F41效价为26～28,987P效价为28～210。说明F41-987P融合蛋白具有良好的抗原性。表明构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基因工程疫苗的候选菌株。

摘要：目的构建家蝇抗菌肽MAF-1A基因原核串联表达体系,在大肠杆菌中表达具有抗菌活性的MAF-1A。方法根据大肠杆菌密码子的偏嗜性进行密码子优化,设计并合成含有5个拷贝的MAF-1A串联基因序列;将合成的串联基因序列克隆到表达载体pET28a并转化大肠杆菌Roseeta(DE3),应用IPTG诱导表达5×MAF-1A串联重组蛋白;通过SDS-PAGE电泳、Western Blot对表达产物进行分析;用肠激酶专一性切割经Ni-NTA纯化后的5×MAF-1A重组串联蛋白,得到MAF-1A单体;采用微量稀释法检测MAF-1A单体对白念珠菌的体外抗菌活性。结果 5×MAF-1A蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达,28℃、0.8mmol/L IPTG诱导12h可达最大表达量;酶切后的抗菌肽MAF-1A单体对白念珠菌的MIC和MBC分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL。结论成功构建MAF-1A原核串联表达系统,重组表达的MAF-1A对白念珠菌具有较高的抑杀活性。

摘要：为研制新型棘球蚴病基因工程疫苗,根据GenBank公布的细粒棘球蚴Eg95基因序列,针对其中一段348 bp高度亲水的优势表位序列设计引物,扩增Eg95s基因,利用同尾酶法基因同向串联方案,获得3拷贝Eg95s串联体。分别用两种表达载体pGEX-6p-1和pET-32a构建重组质粒,转化入3种大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)、Rosseta(DE3)和Origami(DE3),对其进行IPTG诱导表达,经免疫印迹分析结果表明,均能正确表达具有免疫原性的Eg95s蛋白。通过重组蛋白的表达量、可溶性、纯化方法等方面的比较,对Eg95s重组表达系统的载体及宿主菌进行了优化,结果表明,3拷贝的串联Eg95s在以pET-32a为表达载体,Rosseta(DE3)为宿主菌的系统中表达最佳。最终获得了表达量高、可溶性好、纯化方便的Eg95s重组蛋白表达系统,为大规模生产棘球蚴病基因工程疫苗提供了科学依据。

摘要：目的:完成钝尾毒蜥Exendin-4基因在大肠杆菌中的串联高效表达。方法:按照大肠杆菌偏爱密码子设计Exendin-4基因片段,利用同尾酶构建多拷贝串联的表达载体,于大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE鉴定结果,表达产物Ni柱纯化后肠激酶切割,高效液相色谱及四级杆-飞行时间质谱纯化、鉴定,确定目标产物,作用胰岛瘤细胞INS-1检测胰岛素释放活性。结果:成功构建重组载体pET28a-(Exendin-4)n(n=2,4,6),且均获得可溶性表达产物,重组表达蛋白经切割、纯化、鉴定和制备,最终得到纯度98%的Exendin-4,其具有与标准品相似的促葡萄糖刺激的胰岛素释放活性。结论:试验成功利用串联表达方式制备有活性的Exendin-4,为下一步2型糖尿病治疗药物的研究奠定了基础。