摘要：通过比对GISAID登录的乙型流感病毒Victoria谱系、Yamagata谱系HA基因序列,选择保守区域设计并合成1对引物及2条荧光探针,以实验室保存的乙型流感毒株RNA为模板分别扩增Victoria谱系和Yamagata谱系HA基因片段,构建重组质粒标准品pUC57-Vic和pUC57-Yama,经PCR及测序鉴定正确后作为质粒标准品,初步建立乙型流感病毒的TaqMan荧光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)分型检测方法。结果显示,该方法可以特异的鉴别检测乙型流感Victoria谱系、Yamagata谱系病毒RNA,对甲型流感病毒、EB病毒、腺病毒等RNA/DNA的检测结果均为阴性;对重组质粒标准品的检测限分别为333、2940拷贝/μL;批内与批间的重复性试验的变异系数均小于2%,表明所建立的检测方法特异性良好、灵敏度较高、重复性好;利用该方法与常规反转录PCR(RT-PCR)方法对10份流感样病例咽拭子进行检测,检测结果一致(3/10)。结果表明,本试验建立的乙型流感病毒TaqMan荧光定量PCR分型检测方法能够检测乙型流感病毒,为乙型流感病毒Victoria谱系及Yamagata谱系的鉴别提供更加快速准确的定量检测手段。

摘要：目的建立乙型(B/Yamagata和B/Victotria系)流感病毒荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据乙型流感病毒(B/Yamagata和B/Victotria系)血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸(neuraminidase,NA)遗传差异,构建含B/Yamagata系流感病毒HA(120 bp)、NA(122 bp)及含B/Victotria系流感病毒HA(147 bp)和NA(141 bp)目的序列的重组标准品质粒,并设计特异性引物和探针,绘制标准曲线,建立qRTPCR检测方法。验证该方法的灵敏度、特异性和重复性,并利用建立的方法检测不同年份乙型流感病毒疫苗株和临床分离的季节性乙型流感病毒。结果B/Yamagata系病毒(HA和NA序列)获得的标准曲线方程为Y=-3.3701 X+41.061,R^(2)=0.996,B/Victotria病毒(HA和NA序列)获得的标准曲线方程为Y=-3.31885 X+40.952,R^(2)=0.996。该方法具有高度特异性,能够区分乙型流感病毒,对甲型流感病毒(A/H1N1和A/H3N2)均无特异性扩增;灵敏度达每个反应10拷贝/μL。该方法可鉴别2018年乙型流感流行株及在MDCK细胞或鸡胚上传代培养的疫苗株,并进行了病毒载量的定量。结论成功建立了乙型流感病毒qRT-PCR检测方法,各项验证参数均可满足检测要求,为乙型流感病毒感染的早期诊断、定量检测及其流行病学调查提供了可行的技术支持。

摘要：摘.要:SARS,流感,乙肝,结核等生物疾病严重威胁人类的健康,为了应对病毒的入侵,必须研究应对病毒的灭活疫苗.而在众多的试验疫苗中,如何选择出最有效的病毒灭活疫苗进行推广,使其发挥最大的作用.下面结合多元统计中的一些方法,介绍如何利用方差分析这种统计方法进行试验设计,分析应对常见的乙型流感病毒的不同疫苗间是否有显著差异,从而找出最佳试验点,即最优的乙型流感病毒灭活疫苗.

摘要：目的建立能够对甲型流感病毒(influenza virus A,INFA)和乙型流感病毒(influenza virus B,INFB)进行区分的液相基因芯片技术,为甲型和乙型流感病毒的分型提供一种高通量、高灵敏度的检测和鉴定方法。方法从NCBI的Gen Bank下载具有代表性的流感病毒基因组序列,利用生物信息学软件Bio Edit进行序列比对,分别设计针对INFA和INFB的简并引物和特异性探针,将设计好的引物和探针与Gen Bank中所有的基因序列进行比对,以验证其特异性。经探针合成、悬浮液相芯片制备和检测条件的优化获得用于甲型和乙型流感病毒分型的液相基因芯片。结果所检测INFA和INFB均可获得特异性杂交信号,非特异性杂交信号不明显,将2种病毒混合,模拟混合病毒感染也可以得到相应的特异性杂交信号。灵敏度评估结果表明INFA的检测灵敏度为1~10空斑形成单位(plaque forming unit,pfu),而INFB为10~100 pfu。将本方法用于检测11份临床样本,其结果与荧光定量分型逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测方法的结果一致。结论本研究初步建立了INFA和INFB的液相基因芯片检测技术,可用于流感病毒的初步筛查和鉴定,并且可以进行混合感染样本的检测,为流感病毒的分型和鉴定提供了一种新的手段。

摘要：目的:应用聚合酶链反应(PCR)连接的限制性片段长度多态性(RELP)技术进行乙型流感病毒及其巴拿马株与维多利亚株两大谱系的鉴别。方法:根据GenBank中登录乙型流感病毒血凝素(HA)区域的核苷酸序列,应用软件进行序列比对,根据HA基因的保守区设计、筛选引物,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增流感病毒HA基因,用限制性内切酶H indⅢ酶切扩增产物并进行琼脂糖凝胶电泳,同时对检测方法进行特异性和灵敏性实验。结果:该方法对乙型流感病毒有特异性,与甲1和甲3型流感病毒无交叉反应。维多利亚株和巴拿马株HA基因均能被特异性引物所扩增,扩增产物经H indⅢ酶切后,乙型流感病毒巴拿马株在电泳谱上出现603 bp与242 bp的两个可见片段,而维多利亚株因无H indⅢ酶切位点,仍呈872 bp的一个片段。该方法检测敏感度可达0.1 TC ID50。结论:该方法是一种灵敏度高、特异性强的乙型流感病毒维多利亚株与巴拿马株鉴别的方法。

摘要：目的　建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT -PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸。方法　根据GenBank登录的流感毒株序列 ,应用生物学软件进行序列比对 ,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选 ,对荧光定量RT -PCR反应条件进行优化 ,检测该方法的特异性和灵敏度。此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测。结果　该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性 ,对甲1 型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应 ,检测的灵敏度达 0 0 1TCID50 ,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸 ,从病毒核酸提取至完成检测仅需 3h左右。结论　本研究建立的TaqMan荧光定量RT -PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法。

摘要：目的建立特异敏感的快速检测含漱液中的流感病毒的分子生物学方法。方法用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲１、甲３和乙型流感病毒ＨＡ基因的ＨＡ１片段，得到各病毒与特异性大小的扩增产物的对应关系。用同样的方法扩增含漱液中流感病毒的ＨＡ基因的ＨＡ１片段。根据这对应关系检测含漱液中的流感病毒。结果以流感病毒的ＨＡ基因为模板设计的三对引物，用多重逆转录聚合酶链反应能特异性地扩增出９４２ｂｐ、１１１７ｂｐ和 ７５１ｂｐ的核酸片段，它们分别和甲１、甲３和乙型流感病毒有稳定对应关系。用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增含漱液中流感病毒ＨＡ基因的ＨＡ１片段，根据扩增产物的大小检出含漱液中的乙型流感病毒。结论 多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应能特异敏感地检出含漱液中的乙型流感病毒。

摘要：目的寻找一种更加简便的方法来定性检测流感病毒抗原阳性细胞。方法设计流式的方法来检测甲型流感病毒(IA)和乙型流感病毒(IB)抗原阳性细胞。采用2种荧光素标记抗体进行流式标记鼻咽拭子的上皮细胞,对157份鼻咽拭子进行甲型和乙型流感病毒抗原检测。结果 157例样本中,直接免疫荧光法检测到甲型流感病毒阳性44例,乙型流感病毒阳性35例,流式法检测到甲型流感病毒阳性39例,乙型流感病毒阳性29例,两种方法检测甲型和乙型流感病毒的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。两种方法检测IA的阳性与阴性总符合率为93.0%,阳性率差异无统计学意义(P>0.05),一致性系数检验κ=0.820,提示两种检测方法一致性较强且有统计学意义(P0.05),一致性系数检验κ=0.687,两种检测方法一致性基本满意且有统计学意义(P<0.05)。结论采用流式法可及早快速筛查甲型、乙型流感标本,操作步骤简便,只需不到2 h就可完成检测,可以推广应用。

摘要：目的建立SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR快速鉴别乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系。方法比对乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系的HA基因,设计特异性引物,采用SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR扩增两系病毒,进行熔解曲线分析,测定各系扩增产物的熔解温度。优化反应体系及条件,进行特异性、灵敏性及重复性评价。结果熔解曲线分析结果显示,乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系扩增产物的熔解温度相差较大,Yamagate系为80.40℃,Victoria系为79.04℃。特异性实验表明,该方法能检测乙型流感病毒,与甲型流感病毒、冠状病毒HCoV-229E、HCoV-0C43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1等呼吸道病毒没有交叉反应。灵敏性实验表明,该方法对Yamagate系和Victoria系乙型流感病毒最低检测限均为102拷贝/μl。对105份乙型流感病毒阳性鼻咽拭子样本的检测结果与WHO的TaqMan探针法完全一致。结论建立的SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR方法可快速检测乙型流感病毒并对两系乙型流感病毒进行鉴别。

摘要：目的 建立一种液相芯片检测方法,用于检测新冠病毒和流感病毒。方法 从NCBI数据库分别下载新冠病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒全基因组序列,在保守区域分别设计扩增引物和检测探针,以各病毒标准品质粒为模板,建立多重PCR扩增体系;将核酸探针偶联至荧光编码微球,建立液相芯片检测体系,并对方法进行评价。结果 基于多重PCR和液相芯片技术建立的新冠病毒和流感病毒的检测方法能够同时检测新冠病毒N基因、ORF1ab基因和S基因,甲型流感病毒M基因和乙型流感病毒NS基因及人类看家基因ACTB基因。检测新冠病毒N基因、ORF1ab基因、S基因的灵敏度为1×10^(4)拷贝/反应,甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒NS基因的灵敏度为1×10^(3)拷贝/反应;可准确检测新冠病毒N基因、ORF1ab基因和S基因,甲型流感病毒M基因和乙型流感病毒NS基因及人类看家基因ACTB基因片段,没有出现相互干扰的现象。结论 建立的方法能同时检测新冠病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒,可作为新冠病毒及流感病毒感染的诊断及流行病学调查的方法。