摘要：目的　用改进的乙型肝炎病毒 (HBV)巢式聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)的基因分型方法初探广州地区HBV基因型分布状态。方法　设计巢式PCR扩增前S基因 ,经限制性内切酶AvaⅡ和DpnⅡ酶切鉴别HBVA～G基因型 ;并对 14 0份乙型肝炎患者血清进行基因分型 ,其中随机挑选 3份进行克隆测序 ,并对 2 0份患者血清进行巢式PCR RFLP重复分型试验 ,以验证此分型技术的稳定性和特异性。同时采用PCR和巢式PCR对 92份乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)阴性血清进行HBVDNA阳性率检测比较。结果　基因分型与测序结果一致 ;基因分型重复试验符合率10 0 % ;92份HBeAg阴性血清经PCR和巢式PCR扩增HBVDNA的阳性率分别为 2 0 7%和 6 8 5 %。14 0份乙型肝炎患者血清中HBV基因型以C型 (94份 )和B型 (4 2份 )为主 ,偶见A型 (4份 )。结论　巢式PCR RFLPHBV基因分型方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性 ,且操作简便 ,适用于临床和流行病学调查研究。

摘要：目的:本研究拟通过广泛筛选特异性引物探针组,建立一套乙型肝炎病毒(HBV)微小RNA-3(miR-3)的绝对定量PCR检测方法。方法:基于茎环引物RT-qPCR方法原理,设计茎环引物进行逆转录,结合SYBR Green法qPCR进行特异性初筛,选择特异性较佳的引物组,再结合TaqMan MBG探针,确定最佳的引物探针组,实现对HBV miR-3的定量检测。结果:共设计和测试了25套茎环引物组,利用基于SYBR Green的RT-qPCR方法,筛选出6套具有良好特异性的引物组,并进一步针对这些引物组设计和测试了相应的探针,获得了可精准定量HBV miR-3的引物探针组。测试结果表明,该引物探针组不但保证了高特异性,而且定量线性范围达到每个反应102~108拷贝,其扩增效率约为88%。结论:本研究确立了一套可用于绝对定量检测HBV miR-3的特异性引物探针组。

摘要：目的:筛选人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白相互作用蛋白的基因,并反向验证HBV全S蛋白候选结合蛋白之间相互作用.方法:将全S基因定向克隆到酵母表达载体pDEST32,构建正向筛选的诱饵质粒并Westernblot法验证其在酵母中的表达.将诱饵质粒与人肝细胞cDNA文库质粒共同转化MaV203酵母细胞,在人肝细胞cDNA文库筛选候选结合蛋白,提取阳性菌落质粒测序,并分析其生物学性质.将筛选出的纤维蛋白原α链中下游序列及不同全S变异株基因,分别定向克隆到pDEST32及pDEST22载体中,利用Westernblot法验证表达.将诱饵质粒与猎物质粒共同转化MaV203酵母细胞,以反向酵母双杂交方法验证初筛结果的可靠性及正确性.结果:正向的酵母双杂交实验,经初筛和再转染实验纤维蛋白原α链可与HBV全S蛋白发生相互作用.再以纤维蛋白原α链为靶基因设计诱饵质粒,以四种变异的HBV全S蛋白为靶基因设计猎物质粒,反向酵母双杂交法证实维蛋白原α链中下游可与不同全S变异体(总差异率2%)发生相互作用,纤维蛋白原α链与全S蛋白的结合域可能为病毒蛋白的前268aa.结论:纤维蛋白原α链中下游可与HBV全S蛋白产生特异性结合,其结合域可能与病毒蛋白的前268aa产生相互作用.

摘要：目的制备乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）DNA定量检测室内质控品,并进行初步评价。方法对HBV各个基因型序列进行多序列比对分析,选择保守序列S区设计引物,PCR扩增HBV S区基因,与pEASY-T1载体连接,构建重组质粒。测序后,将重组质粒稀释成10~7 copies/ml、10~4 copies/ml两个水平,分别作为高值质控品（HBVH）和低值质控品（HBV-L）,分装冷冻于-80℃,并初定靶值。评价自制质控品的精密度和稳定性,绘制室内质控图。结果构建的重组质粒测序结果与目的片段一致,自制HBV DNA 2个水平室内质控品的精密度、稳定性均达到实验要求。结论自制HBV DNA 2个水平的质控品可用于HBV DNA定量检测的室内质控。

摘要：目的　研究在转录起始区域设计硫代反义寡核苷酸抑制鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBVDNA)复制的可行性。方法　设计合成分别基于DHBVPreS1、PreS2、S抗原启动基因的硫代反义寡核苷酸 ,应用Southernblot实验和cpm计数测定其对原代鸭肝细胞中及雏鸭中感染DHBV的DHBVDNA的作用。结果　在 1.5 μmol L浓度下 ,体外抑制率分别是 61.5 % ,69.3 %和 62 .4%。选取PreS1抗原基因起始区段的硫代反义寡核苷酸进行整体动物实验。每只动物每天按 10 μg g体重静脉注射一次 ,共给药 6d。对动物肝脏进行取样分析表明 ,在此剂量下 ,对DHBVDNA的抑制率可达 87.9%。结论　本实验所设计的针对转录起始区的硫代反义寡核苷酸在体内外对DHBVDNA复制均有明显抑制作用 。

摘要：小分子干扰RNA(siRNA)能够在哺乳动物细胞中引起包括病毒基因在内的基因沉默。为了研究多种siRNA联合应用在体外抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制中的效果,本研究设计了12种针对不同HBV靶点的siRNA,转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG22.2.15细胞,并采用了酶联免疫法检测上清液中HBsAg和HBeAg的含量,实时定量PCR法检测细胞中HBV的DNA含量。结果发现这12种分子均能在不同程度上抑制病毒复制。进一步研究表明它们对HBV的抑制作用在一定程度上存在剂量效应和协同作用,单分子siRNA在80nmol/L处对HBsAg和HBeAg的抑制率分别可达到约80%和60%,而多分子siRNA组合在20nmol/L处对HBsAg就能达到90%的抑制率,但对HBeAg表达的抑制率提高不明显。单分子siRNA在80nmol/L处对HBVDNA复制的抑制率可达到90%以上,而多分子siRNA组合在20nmol/L处对DNA含量就能达到约90%的抑制率。本研究的结果为进一步开发新的联合应用多种siRNA治疗HBV的途径打下了基础。

摘要：目的建立一种能同时检测乙型肝炎病毒(HBV)基因组1896位点变异株与野生株的定性方法。方法设计3条特异性引物(组成2对引物),提取血清中HBV DNA模板进行PCR扩增变异株与野生株,取PCR产物在琼脂凝胶(含EB)上电泳,观察结果。结果本次实验共检测40个标本,有11个标本只检测到野生株,8个标本只检测到变异株,其余21个标本都是变异株与野生株混合感染。结论该方法是一种可行的能同时检测HBV基因组1896位点变异株与野生株的定性方法。

摘要：目的建立检测乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)聚合酶链反应法,研究其临床应用价值。方法根据HBV-cccDNA核苷酸序列特点设计PCR引物,应用PCR的方法检测急性和慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化、拉米夫定治疗等病患者的血清、外周血细胞及肝组织cccDNA。结果急性及慢性乙型病毒性肝炎、拉米夫定治疗等病患者血清的HBV cccDNA检出阳性率分别为15.6%、50.0%、21.2%;前两者外周血细胞检出阳性率分别为10.7%、19.6%;慢性乙型病毒性肝炎(含肝硬化)、拉米夫定治疗等病患者肝组织的HBV-cccDNA检出阳性率分别为91.1%、32.8%。结论该方法操作简单、特异性强,可用于HBV-ccc DNA的检测,评价抗乙型肝炎病毒药物的疗效。

摘要：目的对乙型肝炎(简称乙肝)肝病毒进行基因分型,检测患者服用拉米夫定后血清中乙肝病毒突变情况,并进行临床相关性分析。方法设计乙肝病毒突变及基因分型特异性引物和酶切位点,系用限制性片断长度多态性(RFLP)分析法检测突变类型并对乙肝病毒进行基因分型。结果在115份被检测的血清标本中,75份(65%)标本为野生型,18份(15.7%)标本为YIDD突变,10份(8.7%)标本为YVDD突变;在混合型突变中,YIDD+YVDD存在于6份(5.2%)标本中,YMDD+YIDD存在于4份(3.5%)标本中,2份(1.7%)标本为YMDD+YVDD混合突变型;未检测到YSDD突变型。在180位点的突变检测中,98份(85%)标本为野生型,5份(4.3%)标本为rtL180M,L180M+M204I存在于8份(6.96%)标本中,另4份(3.5%)标本为L180M+M204V混合突变型。在115份标本中,102份标本为C基因型,13份标本为B基因型,未发现其他基因型。通过χ2检验,乙肝病毒YMDD突变与患者的性别、血清DNA水平、病毒基因型之间没有相关性(P>0.05),而乙肝病毒YMDD变异与患者服用拉米夫定的时间长短有相关性(P<0.05),用药时间越长,发生突变的几率越大。乙肝患者服用拉米夫定后,180位点的突变和204位点突变具有相关性(P<0.05)。结论采用RFLP分析法可以有效地检测乙肝病毒YMDD突变并对乙肝病毒进行基因分型。

摘要：目的建立鸭乙型肝炎病毒(DHBV)cccDNA TaqMan荧光定量PCR方法。方法用pUCm-T载体和PCR纯化产物连接,转染TOP10菌,筛选阳性菌落,提取质粒,制作外标准品;在DHBV基因组负链两侧设计一对引物,并在引物间设计和荧光标记一段TaqMan探针,严格优化反应物的组成和扩增条件,建立了DHBV cccDNA TaqMan荧光定量PCR方法。结果最低可检出10~4拷贝/ml;批内误差为0.2%～3.14%,批间误差为2.22%～4.43%;在10~5～10^(12)拷贝/ml之间与C_t值具有很好的线性[Ct=-2.8361 ln(x)+41.45,r=-0.9985]。结论该法是一种灵敏度高、特异性强、较为简便的DHBV cccDNA定量检测技术。