摘要：目的:建立乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)B基因型亚型的检测方法,并对其进行临床研究.方法:根据GenBank中20株Ba亚型,10株B j亚型以及25株C型全长基因组序列设计Ba、Bj亚型特异探针以及巢式PCR引物.采用反向杂交技术将B亚型特异探针固定在芯片上,通过与地高辛标记的扩增产物杂交检测B型HBV亚型.对镇江地区200例B基因型HBV血清样本进行亚型分析并对患者HBV DNA YMDD变异进行检测,通过对部分血清中的HBV DNA进行序列分析验证该方法的准确性.结果:200例B基因型HBV患者中,Ba亚型184例(92%),Bj亚型16例(8%).在持续使用拉米呋啶的80例患者中,Bj亚型6(0%)例,均无YMDD变异,Ba亚型74例,YMDD变异21(28.4%)例.结论:镇江地区B基因型HBV以Ba亚型为主,Ba、Bj亚型在服用拉米呋啶1年后发生YMDD变异的几率并无统计学上的显著差异.

摘要：目的在细胞水平上探讨10-23脱氧核酶(10-23DRz)成为新型乙型肝炎基因治疗药物的可能性。方法设计合成针对乙型肝炎病毒(HBV) ayw1亚型前C/C区的2031位点的10-23DRz,并对其进行硫代磷酸化修饰,同时针对该位点设计一条未硫代化修饰的10-23DRz,经脂质体转染HepG22.2.15细胞(简称2.2.15细胞)中观察其对HBV基因表达的抑制效应。结果修饰与未修饰的10-23DRz作用于2.2.15 细胞后均可显著抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)的表达,最高抑制率分别可达93.75%和90.26%,有效抑制持续时间可达96 h,修饰后的脱氧核酶在细胞内对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用时间长于未修饰的DRz,其抑制率的最高值低于未修饰的DRz,但两者明显高于作为对照的反义脱氧寡核苷酸。对2.2.15细胞内HBV DNA复制无明显影响,未见明显的细胞毒性作用。结论经过硫代化修饰的10-23DRz和未修饰的10-23DRz在2.2.15细胞模型中能高效阻断HBV DNA的表达,是一种高度特异性的、高效的基因治疗剂。

摘要：目的应用德尔菲法构建乙型肝炎病毒(HBV)感染孕产妇健康管理优化路径,为加强乙肝母婴阻断提供依据。方法查阅文献并结合前期相关研究,初步构建HBV感染孕产妇健康管理优化路径框架和内容。选择流行病学、临床医学和妇幼保健学方面的专家开展两轮德尔菲咨询,对初步设计的指标进行筛选和修改;根据指标的可行性得分,采用比例分配法确定指标权重。结果参与咨询的专家16人,其中女性13人;年龄为(45.69±5.71)岁;从业(23.06±7.05)年;均为本科及以上学历;副高级及以上职称14人。两轮专家平均积极程度为96.88%,权威系数为0.790,各级指标的重要性、必要性和可行性的协调系数均有统计学意义(P<0.05),可行性的变异系数均<0.250。最终形成了包含6个一级指标、17个二级指标和73个三级指标的HBV感染孕产妇健康管理优化路径;一级指标中,“分娩管理”(0.1734)、“筛查与评估”(0.1728)和“妊娠期管理”(0.1727)的权重较高。结论构建的HBV感染孕产妇健康管理优化路径较为科学和可靠,对于进一步加强乙肝母婴阻断具有一定应用价值。

摘要：根据乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的Ｓ区序列设计了３条引物：ＨＢＳ１（ｗ－／ｒ＋）、ＨＢＳ２（ｄ＋／ｙ－）和ＨＢＳ３，与ＨＢＳ１和ＨＢＳ２配对，经２次聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增。即可在检测有无ＨＢＶ－ＤＮＡ存在的同时对其基因型分类，可检出１０ａｇ的ＨＢＶ－ＤＮＡ，比免疫学方法更灵敏和特异。２５份不同亚型的标准血清中的绝大多数用Ｓ－ＰＣＲ和ＡＧＩＤ／ＲＰＨＡ的分型结果一致，Ｓ－ＰＣＲ的另一突出优越性在于能够对ＨＢｓＡｇ低滴度和阴性标本分型。

摘要：以乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｘ基因序列的异质性表现来探讨ＨＢＶ准种在　慢性感染者中的存在状态。以中国株ＨＢＶ基因序列为依据，设计特异性多聚酶链反应引物，　自９例慢性ＨＢＶ感染患者血清中扩增ＨＢＶ　Ｘ基因，克隆入ｐＧＥＭ　Ｔｅａｓｙ质粒，随机挑选克隆进行Ｄ　ＮＡ测序以确定病毒的变异程度。３７例测序结果提示来源于不同患者ＨＢＶ　Ｘ基因序列高度保守　，但每个序列均不一致。Ｘ区除了存在广泛的碱基点替换突变外，序列的缺失突变占测序克　隆总数的５１．４％（１９／３７）；氨基酸缺失及移框突变多发生于１２３位氨基酸残基之后，可导致Ｘ蛋　白多种羧基端形式。结果提示ＨＢＶ长期携带者体内有ＨＢＶ准种共存，Ｘ区内存在热点缺失突变区，该区突变结果可能影响Ｘ蛋白反式激活功能。

摘要：目的　建立DNA芯片检测乙型肝炎病毒 (hepatitisBvirus,HBV)基因多态性的研究方法并对实验条件进行优化。方法　设计多条寡核苷酸探针 ,在硅烷化芯片的特定位置上 ,用点样仪将探针固定 ,并与PCR扩增的HBV基因相应区段杂交 ,杂交结果影印至硝酸纤维素膜 ,经BCIP NBT避光显色 ,用放大镜观察杂交信号呈暗紫色圆点 ,根据特定位置上杂交信号的有无和与之相应的探针序列来判定基因突变的类型。结果　通过 1次杂交反应可检测HBV前C C区 (nt 1896 1814 )、BCP区 (nt1762 1764)和P区 (nt 52 8 552 )等多个位点的变异 ,与测序分析结果完全一致 ,具有较好的检测灵敏度和重复性。结论　DNA芯片检测HBV基因常见突变位点多态性 ,操作简便易行 ,技术要求不高 ,具有临床推广应用价值 ,而且可以方便地通过向寡核苷酸探针阵列中添加相应探针 ,扩大基因芯片的检测应用范围 。

摘要：目的设计并建立一种新的能够同时测定核酸提取物中乙型肝炎病毒(HBV)前基因组RNA(pgRNA)和DNA的检测方法。方法建立检测HBV pgRNA和DNA的探针法双重荧光定量PCR体系,通过DNA凝胶电泳、定量PCR等实验考察该检测体系的特异性和灵敏度,验证以该方法测定HepG2.2.15细胞及其培养上清中HBV pgRNA和DNA的可行性及准确度。结果建立的探针法双重荧光定量PCR体系具有较好的特异性和灵敏度,测定不同稀释倍数的细胞培养上清时,在稀释倍数和测定结果间具有较好的相关性。但该方法更适用于测定细胞培养上清中的HBV pgRNA和DNA,而不适用于测定细胞样本。结论本实验建立的方法能够避免核酸提取物中由于HBV DNA污染造成HBV RNA定量不准的问题,并且在一管PCR反应中同时实现了HBV pgRNA和DNA的双重检测,极大提高了检测效率,具有潜在的临床应用价值。

摘要：目的建立一种新的单管巢式实时荧光PCR熔解曲线法用于快速灵敏地筛检临床乙型肝炎病毒(HBV)样本核心启动子区nt1758-1777片段缺失突变。方法通过比对分析Gen Bank收录的HBV基因序列,设计通用巢式PCR引物,建立优化方法体系;对340例慢性乙型肝炎患者血清HBV CP区进行扩增,产物直接测序,并随机选择50例样本进行克隆测序,分析nt1758-1777缺失突变检出率。野生型和缺失型标准质粒来自于单克隆测序样本,并对两种标准质粒及克隆检测样本进行荧光定量PCR扩增,获得熔解曲线及熔解温度,得到熔解曲线的阳性标准。用新建立的方法对340份样本进行检测,并用焦磷酸测序加以验证。结果直接测序法检出16例(4.7%)阳性样本。标准质粒及克隆检测样本中缺失序列比例≥15%的样品,其熔解温度(Tm)≥88.3℃,遂将≥88.3℃作为新方法的阳性标准。用新方法检出47例(13.8%)阳性样本,其中用焦磷酸测序验证缺失突变比例≥1.0%的样本38例,<1.0%的样本9例;15份阴性样本缺失突变比例均<1.0%。用焦磷酸测序验证缺失突变比例1.0%作为阳性阈值,新方法对nt1758-1777缺失检测的阳性符合率为80.9%,阴性符合率为100%,两种方法的一致性Kappa值为0.671。结论与直接测序法相比,新方法可显著提高nt1758-1777缺失检出率,结合焦磷酸测序证实,可有效提高检测的准确性和经济性。该方法对建立HBV其他缺失突变的检测方法也可提供借鉴。

摘要：目的设计与构建特异性结合乙型肝炎病毒增强子1(HBV Enh1)的锌指蛋白人工转录因子(ZFP-ATF),检测在Hep G2.2.15细胞内的表达、对细胞生长影响及观察其抑制HBV DNA复制与表达的作用。方法构建含结合结构域ZFP与抑制性效应结构域Krüppel相关盒(KRAB)的人工转录因子(ATF),进行相关修饰、优化后,将人工合成ATF核酸序列插入真核表达质粒载体pc DNA3.1(^+),测序鉴定其正确性,X-treme GENE HP转染Hep G2.2.15细胞,共聚焦显微镜下观察ATF蛋白表达情况,CCK-8法检测ATF对细胞生长的影响,ATF转染24、48、72 h后,采用实时定量PCR、ELISA、Western blot法检测对HBV DNA复制与表达的抑制作用。结果成功构建pc DNA3.1-ATF(nls-ZFP-KRAB-FLAG)真核表达载体,ATF在Hep G2.2.15细胞中能正常表达,且对细胞生长无明显的影响,ATF具有抑制HBV DNA复制与表达的作用,在转染72 h后抑制作用达最高,抑制率达68.0%。结论构建的ATF在Hep G2.2.15细胞中能够正常表达且无毒性作用,可特异性结合HBV Enh1靶序列并具有抑制HBV DNA复制与表达的作用。

摘要：目的 评价基于CRISPR-Cas13a技术的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)检测方法的应用价值。方法 收集25例HBV感染患者和5例非HBV感染患者的肝组织标本,提取肝组织的总DNA,依次使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)消化;设计HBV cccDNA的特异性引物,扩增消化后的产物;利用CRISPR/Cas13a技术建立CRISPR-HBV cccDNA检测方法,通过HBV cccDNA质粒和临床样本对该方法进行评价,并利用数字PCR和荧光定量PCR方法进行比较。结果 本研究建立的方法检测HBV cccDNA质粒的灵敏度为1 copies/μL,显著高于数字PCR(10 copies/μL,P<0.01)和荧光定量PCR(10^(3)copies/μL,P<0.01);建立的方法检测HBV cccDNA阳性样本的灵敏度为1 copies/μL,与数字PCR相同,高于荧光定量PCR(10 copies/μL,P<0.01);建立的方法对25例HBV感染的临床肝组织样本的检出阳性率为80%,均高于数字PCR(64%)和荧光定量PCR(48%)。结论 本研究建立的CRISPR-HBV cccDNA检测方法在乙肝患者肝组织标本HBV cccDNA检测中具有较高的灵敏度,为评价乙肝患者的临床治疗效果和监测停药复发等情况提供了有效帮助。