摘要：通过将乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)与NusA-tag融合表达,以获得能够在大肠杆菌中可溶性表达并且具有较好活性的重组蛋白。首先,根据Aldh2的基因序列设计引物,引入EcoRI和XhoI的酶切位点,聚合酶链式反应扩增出Aldh2基因片段,连接到pMD19-T-simple载体,并转化到大肠杆菌DH5α菌株。测序正确后,双酶切处理,将Aldh2基因片段克隆到表达载体pET44b(+)上NusA-tag下游的EcoRI和XhoI酶切位点之间,得到pET44b(+)-NusA-Aldh2重组载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导,表达的融合蛋白具有良好的溶解性,主要存在于上清液中。融合蛋白的最优表达条件为IPTG浓度0.25 mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间3 h。重组蛋白的最适反应温度为37℃,在pH 7.0时达到最好的催化效果。不同金属离子如Ca^(2+)、K^(+)、Na^(+)、Mg^(2+)、Mn^(2+)都对酶有激活作用,且Mg^(2+)效果最好,最佳的酶活性为1.64 U/mL。而野生型ALDH2在大肠杆菌中表达时完全以无活性的包涵体形式存在,复性后得到的酶活性为1.43 U/mL。本研究通过引入NusA进行融合表达,实现了ALDH2在大肠杆菌中的可溶性表达,且重组蛋白的活性优于包涵体复性蛋白。这些结果表明利用NusA进行融合表达是制备重组ALDH2的一个良好方法。

摘要：目的 探讨胃癌细胞中的乙醛脱氢酶2(ALDH2) m RNA发生可变剪接。方法 设计ALDH2基因特异性引物,用胃癌细胞(AGS、HGC-27、MKN45)、正常人胃黏膜上皮细胞GES-1和人外周全血白细胞提取RNA,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,然后对ALDH2扩增产物进行测序分析;使用DNAStar软件分析ALDH2变异体(V)的开放阅读框(ORF)。结果 ALDH2变异体1(V1)外显子2和外显子4发生可变剪接,V1外显子1的3’端和外显子3的5’端3个不同的位点发生可变剪接,V1存在8个长度超过100氨基酸的ORF。结论 ALDH2 m RNA存在多种可变剪接形式,提示其存在复杂的蛋白表达功能。

摘要：目的建立一种Taq Man-MGB探针方法用于快速检测乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因多态性。方法根据NCBI网站公布的ALDH2 rs671基因序列,针对rs671位点基因多态性设计特异引物和Taq Man-MGB探针,建立和优化实验条件;与测序法作比较,进行一致性分析。验证Taq Man-MGB探针检测方法的准确性。结果Taq Man-MGB探针法和测序法平行检测样本60例,两种检测结果进行Kappa分析,Kappa=0.962。结论两种检测方法结果一致性良好,建立了检测ALDH2 rs671基因多态性的Taq Man-MGB方法。

摘要：目的基于"PCR-金磁纳米微粒层析法"建立用于口腔拭子样本类型的乙醛脱氢酶2(ALDH2)Glu504Lys基因分型检测技术。方法以口腔拭子为样本类型,利用ARMS-PCR技术,针对ALDH2 Glu504Lys基因设计特异性引物,在实验室PCR常规反应条件上以金磁纳米层析试纸条为检测平台对各项条件进行优化,以确定最优PCR-金磁微粒ALDH2Glu504Lys口腔拭子反应体系和PCR反应程序。收集60例口腔拭子样本,利用金磁纳米层析检测技术进行检测,并用测序结果进行验证。结果检测的60例口腔拭子样本中杂合突变型16例,野生型42例,纯合突变型2例,金磁微粒层析法检测基因分型结果与测序结果符合率100%。结论建立了基于金磁纳米微粒ALDH2 Glu504Lys口腔拭子基因检测技术,该方法具有快速、简便和准确的特点,迎合了当下POCT的发展趋势,值得临床推广和应用。

摘要：单细胞层面的蛋白质组学研究极具挑战.本文报道了一种简单、快速的单细胞蛋白质组学方法(Mad-CASP),创新地设计了一套质谱兼容的合成肽段:(1)样品制备过程中,合成肽段的包被可以有效地减少样品损失;(2)质谱数据采集时,合成肽段的信号被摒除,对样品信号无影响;(3)全流程无需特殊设备,可在3~4小时内完成96孔样品的高通量制备.结合图谱库和新的质谱数据采集模式,Mad-CASP技术可从单个HeLa细胞中鉴定出124093个蛋白质.随后利用Mad-CASP技术分析了来自健康人和冠状动脉慢性完全闭塞(CTO)患者的240个外周血CD34^(+)单细胞.基于单细胞蛋白图谱,本研究首次揭示外周血CD34^(+)细胞的功能亚型,证实其在CTO进展中的“双刃剑”作用,提示靶向乙醛脱氢酶2在CTO治疗中的潜在作用.综上,本研究利用Mad-CASP技术首次解析了循环CD34^(+)细胞的单细胞蛋白质图谱,提示Mad-CASP技术在稀缺临床样本的单细胞蛋白质组学检测方面极具潜力.