摘要：目的建立1种检测16型乳头状瘤病毒(HPV16)7862nt上CpG位点非甲基化的方法.方法培养宫颈癌SiHa和CaSki细胞系,提取基因组DNA,通过亚硫酸氢钠修饰将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶,PCR法预扩增包含该位点的HPV序列,针对该CpG位点5'端序列设计并合成延伸引物,再在同时含ddTrP和ddCTP的体系中进行延伸反应,用变性高效液相色谱法同时分离检测2种延伸产物.结果在SiHa细胞的延伸产物中仅能够检测到代表未甲基化位点的ddTTP延伸产物(保留时间6.7 min),而在CaSki细胞的延伸产物中不仅能够检测到ddTTP的延伸产物,还能检测到代表甲基化位点的ddCTP的延伸产物(保留时间6.3 min).结论所建立的引物延伸-变性高效液相色谱联合检测法能够同时检出感染细胞中非甲基化活化和甲基化失活的HPV病毒拷贝,灵敏度达1/500(0.2%).

摘要：目的探讨人乳头状瘤病毒（HPV）16型多肽疫苗的制备，并观察HPV16多肽疫苗的体内外效应。方法（1）针对抗原加工相关转运子（TAP）设计HPV16E7蛋白的主要组织相容性复合物I类分子（MHC—I）的抗原结合表位，利用生物信息学分析平台筛选出一致性较高、特异性及亲和力较强的HPV16E7多肽作为研究对象制备HPV16多肽疫苗用于以下研究，本研究共筛选出3段多肽，分别命名为E7Pa、E7Pb、E7Pc。（2）C57BL／6小鼠注射鼠肺上皮细胞株TC-1细胞（为鼠源性的HPV16阳性的肿瘤细胞株）后，采用等额抽取的随机方法分为5组，E7Pa＋二核苷胞嘧啶（CpG）、E7Pb＋CpG、E7Pe＋CpG[均为实验组，分别加入终浓度为50μg／ml的E7Pa、E7Pb、E7Pc和终浓度为12mg／L的刀豆蛋白（ConA）]、CpG（为阳性对照，加入终浓度为12mg／L的ConA）和空白对照组（不做任何处理）。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测各组作用不同时间后小鼠脾T淋巴细胞的体外增殖效应，乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测小鼠脾T淋巴细胞在不同效靶比下的体外细胞毒T淋巴细胞（CTL）活性，实时荧光定量RT—PCR技术检测小鼠肿瘤组织中1干扰素（IFN-γ）、白细胞介素2（IL-2）mRNA的表达水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠外周血中IFN-γ、IL-2的表达水平，通过定期测量比较各组小鼠接种HPV16多肽疫苗后体内肿瘤体积的变化。结果（1）本研究筛选出了一致性较高、特异性及亲和力较强的3段HPV16E7多肽作为研究对象制备HPV16多肽疫苗，分别命名为E7Pa、E7Pb、E7Pe。（2）MTT比色法检测显尔，在接种疫苗24、48、72、96h后，以E7Pa＋CpG组的增殖效应最明显，其细胞增殖率分别为（131±32）％、（302±15）％、（552±28）％、（731±24）％，明显高于空白对照组的（72±15）％、（120±57）％、（176±41）％、（288±29）％（P〈0．01）；E7Pb＋CpG、E7Pe＋CpG、CpC组的细胞增殖率也均明显高于空白对照组（P〈0．05）；但E7Pb＋CpG、E7Pc＋CpG、CpG组间比较，差异则无统计学意义（P〉0．05）。LDH释放法检测显示，效靶比为100：1时，E7Pa＋CpG、E7Pb＋CpG、E7Pe＋CpG、CpG和空白对照组CTL活性分别为（85．9±3．0）％、（55．9±2．5）％、（60．2±1．5）％、（41．0±1．7）％和（4．1±1．0）％，E7Pa＋CpG组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；E7Pb＋CpG、E7Pc＋CpG、CpG组分别与李白对照组比较，差异也有统计学意义（P〈0．05）；但E7Pb＋CpG、E7Pe＋CpG、CpG组间比较，差异则无统计学意义（P〉0．05）。在肿瘤组织及外周血中，小鼠IFN-γ、IL-2的表达水平，E7Pa＋CpG组与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）；E7Pb＋CpG、E7Pc＋CpG和CpG组分别与空白对照组比较，差异也均有统计学意义（P〈0．05）；但E7Pb＋CpG、E7Pe＋CpG、CpG组间比较，差异则无统计学意义（P〉0．05）。小鼠体内的肿瘤体积，各实验组肿瘤生长均明显被抑制，接种后第60大，E7Pa＋CpC组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；E7Pb＋CpG、E7Pc＋CpG和CpG组分别与空白对照组比较，差异也均有统计学意义（P〈0．05）；但E7Pb＋CpG、E7Pc＋CpG、CpG组间比较，差异则无统计学意义（P〉0．05）。结论在动物模型中，针对TAP筛选的HPV16E7多肽联合cpG制备的HPV16多肽疫苗，可以有效治疗HPV16E7阳性的肿瘤。

摘要：目的探讨凋亡相关基因survivin在宫颈癌前病变和宫颈癌组织中的表达及其与人乳头状瘤病毒(HPV)感染的相关性。方法选取76例宫颈癌前病变或宫颈癌患者,另取10例正常宫颈组织作为对照。应用免疫组织化学SP法检测各组宫颈组织中凋亡相关基因survivin的表达;设计高危型HPV(HPV16,18,31,33,58等)通用引物,以touch-downPCR法检测各组宫颈组织中高危型HPV的感染率。结果(1)从正常宫颈→癌前病变→宫颈癌,survivin表达逐渐增强(P0.05);(3)从正常宫颈→癌前病变→宫颈癌,高危型HPV阳性率逐渐升高(P0.05);(5)survivin与高危型HPV在宫颈癌组织中的表达呈正相关(P<0.05)。结论survivin表达及高危型HPV感染可能与宫颈癌的发生、发展密切相关,两者在宫颈癌的发病机制中可能起着协同作用。

摘要：目的构建能表达L1E7融合蛋白的原核表达菌株,纯化蛋白,并观察其免疫效果。方法用PCR方法分别扩增出C末端部分缺失的HPV16L1基因和HPV16E7编码基因N端部分序列。将上述基因连接,构建融合基因L1ΔCE7N并将其插到原核表达载体pGEX-2T中进行融合蛋白表达纯化,然后观察其免疫效果。结果L1ΔCE7N融合基因测序结果表明,序列与设计相符,读码框架正确。将其插入原核表达质粒在大肠埃希菌中获得高效表达;经Wester-Blot鉴定在相对分子质量约85×103处有特异性表达带,与预期相符。用亲和层析和分子筛可纯化L1ΔCE7N融合蛋白,将其免疫C57BL/6小鼠,结果表明融合蛋白能诱发高滴度L1、E7抗体,并能保护小鼠免受TC-1肿瘤细胞的攻击。结论本实验在原核系统中高效表达并纯化了L1ΔCE7N融合蛋白,该蛋白可作为预防和治疗HPV16感染以及相关肿瘤的候选疫苗株。为研制HPV16预防治疗性疫苗探索一条经济、易普及的途径。

摘要：目的高效表达HPV31和52型L2融合蛋白疫苗，并评价其免疫效果。方法根据GenBank上公布的HPV31、52型L2蛋白11-200位氨基酸序列，设计合成两个型别L2该区域对应的优化密码子基因融合序列，并将其克隆至原核表达载体中。利用原核表达系统表达HPV31和52L2融合蛋白，纯化目的蛋白后免疫小鼠，用血清抗体检测及HPV假病毒体外中和试验评价融合蛋白疫苗的免疫效果。结果HPV31和52L2融合蛋白在原核表达体系中呈高效表达，表达量约占全菌20％。融合蛋白加铝佐剂免疫小鼠后，血清中能检测到高滴度的总抗体及一定水平的中和抗体和交叉中和抗体。结论HPV31和52L2融合蛋白能够刺激机体产生广谱中和抗体，为高危型广谱HPVL2蛋白疫苗研发提供了实验室依据。

摘要：目的探讨广东地区宫颈癌组织中HPV16肿瘤相关性抗原E7基因序列的多态性。方法采用通用引物PCR直接测序法对宫颈癌标本中的HPV分型,从含有HPV16型的标本中采用自行设计的多重引物通过巢式PCR扩增出HPV16E7,经DNA序列测定法检测其基因变异,进而寻找其热点突变。结果50例宫颈癌组织HPV-DNA的检出率为78%,其中HPV16和HPV18型混合感染18例,单纯HPV16型感染15例。33例含有HPV16型的标本中扩增出25例HPV16E7,其中17例647位核苷酸“T”变异“C”,导致相应的蛋白质由天冬氨酸变异为丝氨酸。结论广东地区宫颈癌组织中HPV16E7DNA序列发生碱基替换的区域主要在647位至846位,热点突变点为Nt647和Nt846。

摘要：目的:(1)探讨在体细胞固相转染siRNA的可行性、安全性及有效性。(2)探讨改变宫颈表面黏膜通透性提高转染效果的可能性。方法:(1)设计针对HPV16 siRNA,长度为21nt,采用Cy3荧光标记,制备siRNA-Lipo2000-卡波姆凝胶。(2)选新西兰雌性未孕兔12只,随机分为实验组及对照组,实验组在转染前使用200mmol/L高渗盐水处理兔宫颈表面10min,对照组则使用生理盐水处理兔宫颈,将siRNA-Lipo2000-卡波姆凝胶1.5mL涂于兔宫颈表面,进行siRNA转染,持续24h。24h后将兔处死,取其宫颈组织。(3)肉眼观察宫颈局部有无红肿、破溃等改变,取部分作快速冰冻切片,荧光显微镜检测转染siRNA的转染效果;部分组织进行石蜡包埋切片,普通显微镜观察宫颈局部组织细胞形态,评估siRNA-Lipo2000-卡波姆凝胶的副反应。(4)将12只荷HPV宫颈癌SCID小鼠随机分为siRNA转染组及对照组,转染组使用siRNA-Lipo2000-卡波姆凝胶进行基因治疗,对照组仅使用Lipo2000-卡波姆凝胶,转染后取瘤体,采用PCR检测治疗前后瘤体中HPV16-DNA滴度,鉴定siRNA-Lipo2000-卡波姆凝胶疗效。结果:(1)高渗氯化钠预处理组及对照组兔宫颈局部上皮组织内均可见红色的荧光;被转染组织局部无红肿、破溃等不良反应。宫颈局部组织结果正常,细胞形态完整,局部无炎性细胞浸润。(2)使用siRNA-Lipo2000-卡波姆凝胶治疗后小鼠瘤体中HPV-DNA的滴度较前明显下降(P<0.05)。结论:(1)siRNA可通过Lipo2000成功转染入在体宫颈局部组织细胞中,siRNA-Lipo2000-卡波姆凝胶对宫颈局部组织无明显毒、副反应。(2)siRNA-Lipo2000-卡波姆凝胶可有效降低荷SiHa细胞宫颈癌瘤体中HPV16-DNA滴度,具有抑制HPV复制的作用。(3)目前没有足够的证据表明转染前增加宫颈黏膜的通透性可以提高siRNA的转染效果。

摘要：【目的】准确检测口腔鳞状细胞癌及正常口腔粘膜中人乳头瘤病毒 16型 (HPV16)的感染状况 ,探讨人乳头瘤病毒 16型与人口腔鳞状细胞癌之间的关系。【方法】从 30例未经治疗的口腔鳞状细胞癌患者肿瘤组织及 30例健康志愿者正常口腔粘膜切取标本 ,液氮冷冻保存 ;常规提取组织DNA ,设计HPV16E7转化基因特异性引物 ,进行聚合酶链反应 ,对PCR结果进行检测 ,记录结果。【结果】 30例口腔鳞状细胞癌患者中检测到 11例HPV16阳性 ,感染率 36 7% ;30例正常对照组中检测到 4例HPV16阳性 ,感染率 11 1%。经 χ2 检验 ,两者差别有显著性。【结论】人乳头瘤病毒 16型与人口腔鳞状细胞癌有一定关系 ,但HPV16在人口腔鳞状细胞癌发生发展过程中所起的作用还有待进一步研究。

摘要：目的：结合多重连接依赖探针扩增（MLPA）和荧光探针溶解曲线分析技术，建立一种一管法同时检测并分辨15种高危型HPV的方法。方法：根据各HPV亚型的特异性序列设计MLPA探针，并在各亚型的ML—PA探针中加入溶解温度（Tm）不同的人工核酸序列作为识别标志；使用特殊的耐高温连接酶和热启动Taq酶，通过温度控制使探针杂交、连接、PCR在一管反应中顺序进行；以各HPV亚型10^2拷贝至10^6拷贝的标准品质粒作为模版进行敏感度实验；将10^2-10^6拷贝的HPV亚型标准品进行两两混合作为模版，检测本方法对混合样本的检测能力；使用本方法和HPV分型试剂盒（导流杂交法）对临床样本进行平行检测，比较2种方法的差异。结果：本方法可在一次反应内顺序完成MLPA探针杂交、连接、扩增3个步骤，扩增结果可通过不同荧光通道不同Tm值的溶解峰分辨不同的HPV亚型；本方法对标准品的检测灵敏度比经典的MLPA3步法反应下降约一个数量级；本方法可同时检测至少2种HPV亚型的混合感染；对临床阳性标本的检出率与导流杂交法结果基本一致。结论：本研究成功建立了一种利用一管法MLPA荧光探针溶解曲线技术检测15种高危型HPV的方法。

摘要：目的克隆高危型人乳头状瘤病毒(HPV)E5基因,并对HPV16E5基因进行序列分析。方法收集10例安徽省立医院妇产科宫颈癌患者手术中癌变部位病理标本,提取总DNA,设计两对嵌套特异性引物,对模板进行PCR扩增,纯化的目的片段与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌TG1,筛选阳性克隆并测序。结果获得两个样本的E5基因HPV-E5-6和HPV-E5-7,全长均为252 bp,两者测序结果完全一致。构建HPV-E5-6/7与HPV16其它E5基因的系统关系树,显示出他们与HPV16E5(AF120701)亲缘关系最近。结论HPV16E5序列保守性强,特异性引物可有效检测HPV16E5基因,E5基因的获得为进一步研究它的功能建立了良好基础。