摘要：目的 :体外实验观察乳酸脱氢酶-A(lactate dehydrogenase-A,LDHA)短发夹RNA对胆管癌细胞系Hucct1 LDHA表达的抑制效果,筛选出针对LDHA基因有效的干扰靶点,并检测LDHA表达下调后,细胞增殖活力的改变情况。方法:设计合成干扰LDHA表达的寡核苷酸片段,经退火、连接等步骤克隆到线性化pGPU6/GFP/Neo真核表达载体,转化入DH-5α大肠杆菌中扩增,经质粒抽提纯化后测序鉴定。重组质粒用脂质体法转染胆管癌细胞系,荧光显微镜观察转染效率;并分别利用RT-PCR及Western blot技术检测LDHA mRNA及蛋白表达,验证短发夹RNA的干扰效果。将干扰效率最高的质粒转染Hucct-1,MTT法检测干扰组较对照组细胞增殖的变化。结果:成功构建了靶向LDHA基因的3个shRNA质粒表达载体,脂质体法平均转染效率为(80±5)%。荧光定量RT-PCR和Western blot显示瞬时转染si-LDHA-1、si-LDHA-3的Hucct1细胞LDHA mRNA和蛋白表达均较阴性对照组有不同程度的下降,其中si-LDHA-3干扰效果尤为明显。MTT法检测显示转染组Hucct1细胞较阴性对照组增殖减慢,转染后96 h两组差异具有统计学差异(P<0.05)。结论:重组质粒能有效干扰胆管癌细胞Hucct1中LDHA基因的表达,经瞬时转染筛选出了有效干扰靶位,下调LDHA的表达,明显抑制胆管癌细胞系Hucct-1的增殖活力。

摘要：目的:观察靶向乳酸脱氢酶a(lactate dehydrogenase-A,LDHA)的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对肝癌Hep G2细胞系的干扰效率及其对细胞增殖与迁移的影响。方法:设计合成LDHA及对照e GFP shRNA序列,克隆至真核表达质粒p LKO.1-TRC,质粒抽提纯化后测序鉴定。重组质粒用脂质体转染肝癌细胞系,采用反转录(RT)-PCR和免疫印迹检测LDHA的表达,验证shRNA的干扰效率。采用CCK-8和克隆形成实验检测干扰LDHA后细胞增殖的变化,划痕实验检测干扰LDHA对细胞迁移的影响。结果:成功构建针对LDHA和对照e GFP的shRNA表达质粒。与转染sh-e GFP组相比,转染sh-LDHA组Hep G2细胞中LDHA mRNA和蛋白表达水平明显降低(P均<0.05)。与sh-e GFP组相比,sh-LDHA组72,96 h细胞增殖明显降低,克隆形成数减少,细胞迁移距离短(P均<0.05)。结论:LDHA的干扰质粒能有效干扰LDHA在肝癌Hep G2细胞中的表达,明显抑制Hep G2细胞的增殖活力和迁移能力。