摘要：为分离纯化人类端粒酶复合体并对其蛋白质组分进行分析 ,自行设计一套特异的以端粒重复序列为配体 ,以亲和磁珠为介质 ,以竞争性碱基序列为洗脱原则的寡核苷酸亲和纯化法 ,对He La细胞端粒酶复合体进行分离纯化 .并采用近年发展起来的主要用于检测序列特异性 DNA结合蛋白的凝胶迁移阻滞分析法对纯化产物进行鉴定分析 .应用 SDS- PAGE对纯化蛋白质亚基组分进行分析与鉴定 ,并采用电泳迁移率和已知蛋白质分子质量标准的对数作图分析测得所得蛋白质亚基成分的相对分子质量 .结果表明 ,纯化产物以 TRAP法检测酶活性可见典型的梯形条带 ;比活性为每 mg蛋白质的 cpm值为 1 80× 1 0 9,纯化倍数 1 80 0 ,得率 90 % .凝胶迁移阻滞法分析显示特异的凝胶迁移阻滞性电泳条带 ;以 SDS- PAGE检测得到 4种蛋白质亚基成分 ,其蛋白质相对分子质量分别为 2 2 0 ku、2 1 2 ku、1 1 6ku和 43ku.由上述可见 ,采用自行设计的寡核苷酸亲和纯化法获得了人端粒酶复合体及 4种蛋白质亚基组分 .

摘要：背景:在生物进化中高度保守的抗原往往具有重要的生物学功能,也是不同种属动物执行相同或相似生物学功能的需要。然而细胞膜保守蛋白质分子的分离与鉴定仍然是蛋白组学的一个瓶颈。目的:探索鉴定细胞膜表面保守蛋白质分子的方法。设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2007-12在解放军第四军医大学免疫教研室完成。材料:BALB/c小鼠。Hela、293T、ECV304、Raji、Colo205、PLA801、7901、Jurkat、L929、SP2/0和CHO等细胞均由解放军第四军医大学免疫教研室冻存。方法:将人宫颈癌细胞系Hela免疫BALB/c小鼠,B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,应用Hela、人结肠癌细胞系Colo205、小鼠成纤维细胞系L929、3T3和中国仓鼠卵母细胞系CHO等细胞进行花环形成系统筛选共阳性杂交瘤,并应用Colo205、人Burkitt淋巴瘤细胞系Raji、人肺癌细胞系PLA801、人胃癌细胞系7901、人T细胞白血病细胞系Jurkat等肿瘤细胞系、胚胎细胞系人胚肾上皮细胞系293T、人脐静脉内皮细胞系ECV304、健康人外周血单个核细胞、小鼠细胞系L929、SP2/0、中国仓鼠细胞系CHO等对所制备的单克隆抗体进行活细胞免疫荧光染色和流式细胞仪鉴定。超速离心法提取Hela、Raji和小鼠Sp2/0细胞膜蛋白,亲和层析法纯化保守蛋白,SDS电泳后切下的目的蛋白带,应用质谱仪(LC-ESI-MS/MS)对酶解的肽进行氨基酸序列分析。主要观察指标:①红细胞花环形成筛选方法的建立。②筛选保守抗原单克隆抗体。③单克隆抗体对细胞膜蛋白的免疫沉淀。④质谱分析。结果:制备了1株可同时识别人肿瘤和胚胎细胞系、小鼠和仓鼠细胞系保守抗原的单克隆抗体C1,并应用该抗体通过亲和层析和质谱分析发现了1个保守蛋白候选分子,是一个目前尚未命名的、含1个V样结构域和3个C样结构域的IgSF成员。结论:亲和层析-质谱法是一种鉴定细胞膜保守分子可行性较好的方法。

摘要：目的优化重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺。方法采用试验设计(Design of Experiment,DOE)方法优化重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺,试验因子为中间清洗液Na Cl浓度(130~870 mmol/L)和洗脱液p H(3.50~4.20),试验响应变量为纯化后样品收率、纯度、残余宿主蛋白含量、外源DNA含量及蛋白A含量,通过DOE构建模型,预测中间清洗液Na Cl浓度和洗脱液p H范围。同时采用DOE方法验证预测工艺参数的稳定性。结果确定中间清洗液Na Cl浓度为400~700 mmol/L,洗脱液p H为3.55~3.75。试验因子在该参数范围内变动时,样品收率均大于80%,纯度均大于97%,外源DNA浓度均低于260 pg/mg,宿主蛋白含量均低于2 300 ng/mg,蛋白A含量均低于6.5 ng/mg。结论成功优化了重组抗CD52单克隆抗体的亲和纯化工艺,且具有较好的稳定性。

摘要：亲和层析作为单克隆抗体分离纯化的关键步骤,其工艺设计对生产效率和成本具有重要影响。对比批次层析和连续流层析两种工艺模式,以期提高亲和层析填料的使用效率,降低生产成本。采用GE公司KTA PCC设备,对比考察两款亲和层析介质在批次层析及连续流层析两种生产模式下产品的关键质量属性,如聚合物、降解物、电荷异构体、工艺杂质残留等,以及关键工艺属性,如回收率、生产效率、填料量等。连续流层析工艺稳定,纯化回收率与批次层析接近。此外,尽管多根层析柱串联上样,洗脱中间体产品关键质量属性无明显差异,但生产效率明显提高,填料用量显著减少。与批次层析工艺相比,连续流层析可显著减少亲和填料的用量,减少缓冲液的消耗,显著提高生产效率,降低生产成本。

摘要：目的利用实验设计(Design of Experiment,DoE)筛选及优化实验对SARS-CoV-2单抗F61亲和层析工艺参数进行筛选及优化,获得最佳工艺条件。方法选择8个可能在亲和层析中影响实验响应结果的工艺参数并制定其水平范围,利用DoE筛选实验对选择的工艺参数进行8因子2水平筛选实验,通过检测响应值,用统计学软件拟合数学模型,经帕累托图分析获得3个显著影响关键质量属性的关键工艺参数(P<0.05),再选择DoE响应曲面法对关键工艺参数进行优化实验。首先完成全析因实验设计部分,检测响应结果拟合数学模型,分析弯曲项P值判断显著因子的工艺参数范围处于最佳范围内(弯曲P<0.05)后,再根据实验的序贯性补齐中心复合表面设计(central composite face-centered design,CCF)实验,通过检测响应结果拟合响应曲面模型,获得工艺最佳条件范围,最终通过重复试验验证最佳参数值的稳定性。结果在筛选实验中获得在亲和层析阶段影响F61的显著因子为洗脱缓冲液pH、洗脱缓冲液盐浓度、中间淋洗缓冲液盐浓度、平衡缓冲液盐浓度。通过CCF实验最终获得亲和层析中关键工艺参数的最佳条件,当洗脱缓冲液pH为3.2、洗脱缓冲液盐浓度为0.07 mol/L NaCl、中间淋洗缓冲液盐浓度为0.31 mol/L NaCl,F61在亲和层析阶段收率达95.25%,宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量为97.33 ppm,样品单体纯度达98.51%。结论用不同类型DoE方法进行了F61亲和层析阶段工艺参数的筛选和优化,获得了最佳工艺条件,为F61纯化工艺的建立奠定了基础。

摘要：目的:通过DOE(Design of Experiment,实验设计)的实验方法考察亲和层析工艺的参数范围。方法:使用经澄清处理的细胞上清液为上样样品,选取洗脱pH、载量和柱高3个因子为输入变量,以SEC-HPLC单体纯度、回收率为输出响应值,使用全析因DOE模型进行实验。结果:在实验参数范围内,SEC-HPLC单体纯度没有明显的变化。洗脱pH条件则显著影响层析收率;洗脱pH、载量和柱高这3个因子没有明显的交互影响。结论:DOE的实验方法适用于亲和层析的工艺开发,能通过一组实验同时考察多个参数对单抗亲和层析工艺结果的影响,能较快速和全面地确认亲和层析工艺参数范围。

摘要：旨在建立从重组CHO细胞发酵培养液中纯化抗TNF-α单克隆抗体的两步串联层析法。将含有抗TNF-α单克隆抗体的料液经两次离心、一步过滤的预处理后,用protein A填料捕获,阳离子填料Sourec30精细纯化。精细纯化过程中利用Do E的方法,采用CCF(Central composite face)设计,探讨了洗脱p H值及盐浓度对纯化的影响。纯化后的抗TNF-α单克隆抗体经HPLC以及毛细管电泳,检测其浓度、纯度以及多聚体含量。结果显示,亲和层析的最佳洗脱条件为p H4.0。通过DOE优化,为达到质量目标(回收率90%以上,纯度97%以上,多聚体0.3%),筛选出最佳洗脱范围为0.05-0.13 mol/L Na Cl以及p H5.7-6.0,选定p H6.0与0.10mol/L Na Cl作为Source洗脱条件,此时回收率94.3%,纯度97.3%,多聚体0.3%,其质量与参比制剂接近。

摘要：设计合成了一种含有碱性磷酸酶抑制剂——对氨基苯磷酸的新型偶氮染料配基并将其偶联到凝胶Sepharose CL-6B 上,制备出新型的亲和层析介质,分离纯化小牛肠中的碱性磷酸酶。通过考察不同配基密度的层析介质对碱性磷酸酶的选择性,得出配基密度为4.55mg 配基(g 湿胶)-1的层析介质选择性高。用NaCl和Na2HPO4进行阶段洗脱,可使酶的纯化倍数一步达到65倍,活力回收率达到89%。通过测定不同配基浓度下酶的动力学,发现新合成的配基是碱性磷酸酶的竞争性抑制剂,其KI为3.0×10-3mol L-1。

摘要：以蛋白A结构中耐碱性更好的C区为基础,构建一种新型耐碱蛋白A,并偶联至琼脂糖基质,获得新型耐碱蛋白A亲和层析介质,分别用激光共聚焦显微镜和石英晶体微天平研究了人免疫球蛋白(h Ig G)与蛋白A介质的结合过程。结果表明,该介质具有较商品配基更高的结合力和稳定的再生性能,hIgG动态载量达62.0 mg/mL,40次再生操作后载量为初始载量的84%。该介质在抗体纯化领域具有较好的应用前景。

摘要：目的　将甲型流感病毒核蛋白(NP)基因克隆到原核表达载体进行可溶性融合表达,制备纯化的病毒核蛋白,为制备甲型流感病毒单克隆抗体提供材料。方法　提取甲型流感病毒RNA ,设计引物,RT PCR扩增NP基因,利用基因工程的手段,将甲型流感病毒的NP基因在大肠埃希菌中进行融合表达,并将表达产物进行亲和层析。结果　成功构建了甲型流感病毒NP基因原核表达载体,经亲和层析制备了较高纯度的目的表达产物。结论　通过合理控制发酵时间、生长温度和诱导物浓度,制备了较为理想的可溶性甲型流感病毒核蛋白。