摘要：以原核高效表达载体ｐＢＶ２２０为骨架载体，采用互补寡核苷酸插入法在ｐＢＶ２２０多克隆位点的上游插入了起始密码子和６组氨酸编码序列，将此新质粒命名为ｐＢＶ２２２，以此载体表达的目的蛋白在Ｎ段带有Ｈｉｓ６尾以利于ＩＭＡＣ层析快速纯化目的蛋白，酶切及核苷酸序列分析验证了我们的设计。将ＩＬ２和ＧＭＣＳＦｃＤＮＡ克隆入ｐＢＶ２２２载体中，表达的目的蛋白与预期的分子量相同，表达产物以包涵体的形式存在，表达量比非融合蛋白有明显的提高，且这种融合蛋白保留ＧＭＣＳＦ的生物学活性。表达菌体直接用６ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍裂解或首先分离包涵体之后盐酸胍裂解，上清直接ＩＭＡＣ层析，以阶段性或线性ｐＨ梯度洗脱特异的目的蛋白。

摘要：人工设计合成芋螺毒素基因Mr VIB来构建表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plys S进行诱导表达。菌体经超声破碎后利用Ni-NTA琼脂糖柱进行亲和层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析融合蛋白表达。结果表明融合表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB经PCR扩增和测序鉴定具有正确的开放阅读框。SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,经一步亲和层析获得纯度大于90%的融合芋螺毒素达73.6 mg/L。本文成功构建了融合表达载体p ET32a/Trx-EK-Mr VIB,融合芋螺毒素Trx-EK-Mr VIB在大肠杆菌中获得高效可溶性表达。

摘要：目的构建乳铁蛋白抗菌-免疫调节融合肽(LIFP)表达载体,在*** BL21中诱导高表达并进行纯化。方法以乳铁蛋白抗菌肽(LfcinB)与乳源免疫调节肽(PGPIPN)的序列为参照,以连接臂(GGGGS)连接两种肽,设计LIFP基因,并在其5'端设计凝血酶FXa识别的酶切位点。将融合肽基因构建到表达载体pGEX-KG中,转化到*** BL21中,用IPTG低温诱导表达,通过AKTA层析系统纯化融合蛋白,Western blot进行鉴定。结果成功构建pGEX-KG-LIFP原核表达载体,并诱导其高表达。通过AKTA蛋白纯化系统,用亲和层析方法纯化,得到高纯度的融合蛋白。结论成功构建了LIFP表达载体,制备并纯化了LIFP,为进一步研究该肽功能和药物开发奠定基础。

摘要：比较不同Linker连接的促血小板生成素模拟肽二联体(d TMP)的生物活性,筛选高生物活性d TMP的Linker设计。全基因合成4个d TMP基因,将片段克隆到p GEX-4T-1载体,构建重组表达载体p GEX-4T-1/d TMP,筛选阳性目的克隆,转化大肠杆菌BL21(DE3),0.1 mmol/L IPTG诱导表达融合蛋白。超声细胞破碎仪破菌,Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲和层析获得GST-d TMP融合蛋白,凝血酶酶切,再次亲和层析除去GST标签,收集目的 d TMP肽片段,双荧光素酶法检测各目的肽片段的活性。通过实验,正确构建了4个不同的p GEX-4T-1/d TMP表达载体,经表达纯化得到了GST-d TMP融合蛋白,酶切后再次亲和层析纯化,并获得了相对分子质量与理论值3 920,3 640,3 610,3 430相符的4个d TMP肽片段,它们的活性大小依次为:d TMP-Linker3>d TMP-Linker4>d TMP-Linker1>d TMP-Linker2。实验发现,不同的连接肽显著影响d TMP肽片段的生物活性,该实验成功筛选到了活性较高的连接肽Linker3。

摘要：为了获得高纯度牛布鲁氏菌VirB12蛋白及其抗原表位蛋白VB-BW,试验采用生物信息学方法对牛布鲁氏菌VirB12蛋白的理化性质、空间结构、信号肽、结构域、跨膜结构、磷酸化位点、抗原表位等进行预测,在此基础上设计抗原表位蛋白VB-BW;VirB12与VB-BW基因经PCR扩增后与pGEX4T-1载体连接,并转化至*** BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达蛋白;经His-Trap HP亲和纯化后对VirB12与VB-BW蛋白进行SDS-PAGE分析与Western-blot鉴定。结果表明:VirB12蛋白由172个氨基酸组成,理论等电点为10.28,脂肪族氨基酸占比较高,半衰期大于10 h;α-螺旋、β-转角、β-折叠与无规则卷曲结构占总蛋白的比例分别为38.95%、4.07%、13.95%与43.02%;含有15个氨基酸组成LIPO型信号肽与一个OmpA同源区域;无跨膜结构;有13个磷酸化位点;含有7个优势B淋巴细胞抗原表位与4个优势T淋巴细胞抗原表位;设计出的抗原表位蛋白VB-BW共有79个氨基酸,由VirB12蛋白的第67~97位与第130~172位氨基酸经刚性连接子连接组成。扩增出的VirB12与VB-BW基因大小为561 bp与270 bp;重组表达载体BL21-VB和BL21-BW在诱导剂IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导时间为10小时时表达出的VirB12与VB-BW蛋白含量最高,经纯化后最终获得大小为47.7 ku与36.3 ku的VirB12与VB-BW蛋白。说明试验构建出表达VirB12与VB-BW蛋白的原核表达体系。

摘要：根据猪舒血管肠肽氨基酸序列推导、设计、合成了VIP基因。构建重组表达载体pPICZα A VIP。转化Pichiapastoris,在含 1 0 0 μg mlZeocin的YEPD平板上筛选。重组子经Ni NTA介质亲和层析纯化并计算VIP的表达量约为 1 2 5g L左右 ,纯化样品通过小分子质量电泳并与VIP标准样品迁移率对照进一步确定了舒血管肠肽已在巴斯德毕赤酵母中得到表达。

摘要：为了提高水蛭素的生产效率以适应生物医药应用的需求,试验通过对水蛭素基因进行密码子优化,构建了重组水蛭素原核表达系统,并对D600nm值、诱导时间、诱导剂IPTG浓度和诱导温度4种诱导条件进行了探索,同时通过引入试验设计(design of experiment,DOE)方案将4种因素对诱导效率的影响进行进一步系统的优化,使用His-Trap亲和层析对重组蛋白进行纯化,并通过凝血酶滴定法对重组水蛭素的活性进行测定。结果显示,试验成功构建重组水蛭素原核表达载体,水蛭素蛋白为可溶性表达。单因素变量优化后的诱导条件为:在菌体密度D600nm值为0.4时,加入1mmol/L IPTG,37℃下诱导7h,重组水蛭素蛋白表达效率最高,占菌体总蛋白66.5%;而DOE试验优化结果为:在菌体密度D600nm值为0.6时,加入0.82mmol/L IPTG,31.9℃下诱导7.6h,预测重组水蛭素蛋白表达效率最高,占菌体总蛋白72.7%,显著高于单因子变量法优化结果(P<0.05)。进一步分析发现,各影响因素之间存在明显的交互效应,影响了单因素试验结果的准确性。通过亲和层析纯化后的重组水蛭素纯度可达99%,抗凝活性为114ATU/mg。研究成功构建了重组水蛭素原核表达载体,对其表达条件进行了优化,并获得了重组水蛭素蛋白,为水蛭素应用于生物医药奠定了基础。

摘要：目的　表达相对分子质量 180 0 0的截断型人可溶性CD4 0L。方法　针对人CD4 0L(Glu10 8 Leu2 6 1)设计引物 ,以全长人CD4 0L为模板 ,扩增目的基因 ,经pGEM T中间载体进一步连接到pQE 4 0载体 ,构建pQE sCD4 0L表达载体。转化E .coliM15后经IPTG诱导表达 ,分离、洗涤包涵体 ,并利用Ni NTA亲和层析纯化目的蛋白 ,经复性后检测对骨髓瘤细胞SP2 0细胞株的抑制作用。结果　克隆的目的基因为 4 80bp ,经测序与文献报道一致 ,所构建的菌株 (M15 pQE sCD4 0L)经诱导表达目的蛋白量为 2 6 7% ,相对分子质量为 180 0 0 ,纯化后蛋白纯度为96 5 % ,对SP2 0细胞有生长抑制作用。结论　原核表达的截断型人可溶性CD4 0L具有抑制肿瘤细胞生长作用。

摘要：酶学研究是生物化学的重要组成部分,本文介绍了一组酶促动力学实验:亲和层析法对谷胱甘肽转硫酶进行分离纯化,并测定该酶活性,米氏常数Km值及最大反应速度Vm值,测定酶蛋白含量计算酶的比活性.该实验适用于生物学专业本科生的酶学实验训练,获得了良好的教学效果.

摘要：本文以蓖麻蛋白为原料,通过单因素试验和正交试验优化对毒蛋白纯化工艺进行优化。结果表明:最佳工艺条件为缓冲液pH值7.0、缓冲液浓度0.10mol/L、D-半乳糖浓度0.10mol/L和洗脱速度1.0mL/min。优选所得工艺设计合理、结果可靠,可作为蓖麻毒蛋白的分离纯化工艺。