摘要：随着科学的发展和时代的进步,药物化学的研究不仅仅局限于先导化合物的发现及其构效关系的研究,一些小分子药物靶点的确认正逐渐成为阻碍药物化学发展的瓶颈问题。因此,活性小分子化合物靶点的鉴定与确认也成为研究过程中最为关键和艰巨的任务,通常会起到决定性作用。本文简要总结活性小分子化合物靶点验证的现行方法,阐述通过合成探针进行靶标鉴别的手段,介绍探针的设计与合成思想,并列举应用这些方法成功找到靶点的实例。

摘要：为研究家蝇防御素融合蛋白对肿瘤细胞K562有抑制作用，在GenBank中检索家蝇defensin基因，设计特异引物，在家蝇幼虫组织中提取RNA，并通过PCR扩增defensin基因成熟肽部分（Maturedefensin，MD），将该基因与原核质粒表达载体pGEX．6P-1进行重组，构建家蝇抗菌肽重组蛋白pGEX-6P-1／MD。通过双酶切鉴定证明目的片段已稳定融合到载体pGEX-6P-1中并将其转化至BL21（DE3）感受态细胞中，经25℃IPTG诱导在大肠杆菌***5u中表达。用GST—Sefinose亲和层析纯化蛋白，15％SDS—PAGE分析鉴定，可见相对分子量为约30kDa的特异性目的条带。运用琼脂孔穴平板扩散法测定表达产物的活性，得知纯化后的重组融合蛋白pGEX-6P-1／MD对大肠杆菌生长有一定的抑制作用，并首次证明家蝇防御素融合蛋白pGEX．6P．1／MD对肿瘤细胞K562有抑制作用。家蝇抗菌肽融合蛋白pGEX-6P-1／MD被成功克隆和表达，证明纯化融合蛋白pGEX-6P-1／MD对肿瘤细胞K562有抑制和损伤作用，这为以后研发蝇防御素抗菌肽药物提供了依据。

摘要：牛肠激酶由一条结构亚基和另一条催化亚基通过一条二硫键连接而成,其中催化亚基可以识别-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列,其识别位点在全部识别序列之后。该研究从NCBI数据库中查找到牛肠激酶轻链基因序列,用Bitoligo软件设计成两端带有酶切位点和overlap区的18条引物,通过PCR拼接技术合成牛肠激酶轻链基因片段,并克隆至pet-28a(+)载体中NcoI 和XhoI两个酶切位点之间。序列分析正确转化表达载体至ArcticExpress(DE3),37℃培养,当A600为0.8时,向培养液中加入1M IPTG至终浓度0.5mmoL/L,37℃诱导6h,进行非融合表达。离心收集菌体,包涵体经过复性实验后,用Ni2+亲和层析柱和分子筛凝胶柱进行纯化,得到总质量7.5mg的重组牛肠激酶,其纯度可以达到95%,为后期肠激酶的酶切鉴定及大规模制备重组牛肠激酶提供应用基础。

摘要：Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)是Rho族蛋白主要成员,在稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)的侵染致病过程中发挥重要作用。本研究目的是采用结构生物学的方法进一步探究Rac1结构与功能以及与其他蛋白互作的机制,进一步阐释其致病机制。试验以稻瘟菌的cDNA为模板,根据Ras相关的C3肉毒素底物1基因(MoRac1)序列设计特异性引物进行PCR扩增,克隆了MoRac1基因并构建原核表达载体pHAT2-Rac1,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。SDS-PAGE检测与Western blot分析表明,pHAT2-Rac1在BL21(DE3)中表达,大小为25kD。通过亲和层析、离子交换与分子筛对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白。该蛋白的表达与纯化对其结构功能的研究奠定了基础。

摘要：条件性致病菌铜绿假单胞菌是细菌生物被膜研究的模式菌,其分泌的胞外多糖Psl在生物被膜形成中起关键作用。PslD为Psl多糖的转运蛋白,由256个氨基酸构成,生物信息学分析揭示其有N端信号肽且为一次跨膜蛋白。分离纯化完整跨膜蛋白需要去垢剂的作用,去垢剂种类繁多且性质不一,研究设计了一套筛选溶解PslD的去垢剂的方案。通过抗组氨酸标签的Westernblot分析,n-Decyl-β-D-maltopyranoside(DM),n-Decyl-N,N-dimethylamine-N-oxide(DDAO)及n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide(LDAO)被认为溶解PslD的效率较高。通过改变总蛋白与去垢剂比例,进一步优化了去垢剂的溶解条件,即8mg/mL总蛋白质量分数为1%的LDAO。在此溶解条件下,仅通过第一步Ni柱亲和纯化目的蛋白纯度可到达80%以上,这为进一步结晶尝试及其结构生物学研究奠定基础。

摘要：为获得hCuZn-SOD基因,根据GenBank中人铜锌超氧化物歧化酶(hCuZn-SOD)基因碱基序列,设计扩增引物,用RT-PCR方法从人的肝细胞中克隆出hCuZn-SODcDNA序列,并将它插入pUCm-T载体中,经过DNA序列测定证实,该片段序列的一个碱基发生突变(与报道基因相比),引起其编码第116个氨基酸由G变为D.采用定向克隆的方法将hCu Zn-SOD的cDNA片段克隆到表达载体pGEX-2T上,构建表达质粒pGEX-SOD,并转化大肠杆菌BL21(DE3).SDS-PAGE分析证实,经IPTG诱导,融合蛋白GST-SOD获得高效表达.破碎菌体、上清经谷胱甘肽亲和层析初步纯化后,得到纯度达90%的目的蛋白.活性实验表明,GST-SOD具有生物活性.

摘要：为研制SPG相关免疫试剂盒,设计了1对引物,从C群链球菌C40株基因组中扩增出了387 bp的细胞壁结合蛋白G(streptococcal protein G,SPG)基因,该基因编码125个氨基酸,包含了C1和C2两个Ig G结合结构域.构建了原核表达载体p ET28a(+)-SPG,IPTG诱导表达出分子质量约15.0 ku的SPG蛋白,并应用亲和层析柱纯化了SPG蛋白,Western blot分析表明纯化SPG蛋白具有生物学活性.

摘要：近年来,三唑类杀菌剂成为生产上防治小麦赤霉病(Fusarium Head Blight,FHB)的主要药剂,主要作用于甾醇生物合成中的14α-脱甲基酶(CYP51),使真菌麦角甾醇的合成受阻,从而破坏细胞膜功能,起到杀菌的功能。本研究的目的是采用结构生物学的方法探究禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)中14α-脱甲基酶(FgCYP51B)的三维结构、生化功能以及其与三唑类杀菌剂的互作机制,进一步阐释禾谷镰刀菌对三唑类杀菌剂潜在的抗性风险。以禾谷镰刀菌(***)的cDNA为模板,根据14α-脱甲基酶基因(FgCYP51B)序列设计特异性引物进行PCR扩增,克隆了FgCYP51B基因并构建了3个全长表达载体pHAT2-CYP51B、pETM-20-CYP51B和pETM-30-CYP51B以及3个蛋白截短体表达载体pHAT2-CYP51B^(50-527),pETM-20-CYP51B^(50-527)和pETM-30-CYP51B^(50-527),将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3),并利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。结果表明:全长FgCYP51B蛋白在BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中均不表达;重组蛋白pHAT2-CYP51B^(50-527)在大肠杆菌中不表达,而重组蛋白pETM-20-CYP51B^(50-527)和pETM-30-CYP51B^(50-527)成功表达,并通过亲和层析、离子交换与分子筛对重组蛋白进行纯化。该蛋白的表达与纯化为其结构功能的研究奠定了基础。