摘要：目的:构建Rabex-5 RNAi慢病毒表达载体,并转染人乳腺癌细胞株mcf-7,观察其对Rabex-5基因的沉默效应。方法:将设计合成的单链引物退火成双链oligo序列,连接入经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切线性化的pMAGic慢病毒质粒载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性克隆,测序鉴定。用293FT细胞包装产生慢病毒,感染mcf-7细胞,利用Real-time PCR和Western blot鉴定抑制Rabex-5表达的效果。结果:PCR与测序鉴定证实成功构建了Rabex-5 RNAi的慢病毒载体,转染mcf-7细胞后,与未干扰组和阴性对照组相比,Rabex-5的mRNA和蛋白表达下调,以RNAi3的沉默效应最佳。结论:成功构建了Rabex-5 RNAi慢病毒表达载体,其可使mcf-7细胞株Rabex-5表达下调,为进一步研究靶向Rabex-5 RNAi对乳腺癌细胞恶性生物学行为变化及基因治疗研究奠定了实验基础。

摘要：目的利用真核表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP miR载体构建针对人Nrf2基因的微小RNA（microR-NA）真核表达载体,为研究Nrf2基因在化学物毒作用提供参考依据。方法设计特异性针对Nrf2基因的寡核苷酸序列,构建重组载体并命名为pcDNA-Nrf2-A、pcDNA-Nrf2-B、pcDNA-Nrf2-C、pcDNA-Nrf2-D,转染人乳腺癌mcf-7细胞;通过荧光显微镜观察绿色荧光监测转染效率,转染48 h后用荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学检测瞬时转染细胞Nrf2基因mRNA和蛋白的表达变化观察沉默作用来初筛有效的重组载体。结果成功构建miRNA真核表达载体pcDNA-Nrf2;转染效率约为20%~40%;瞬时转染重组质粒48 h后,与空白对照和阴性对照质粒比较,pcDNA-Nrf2-A Nrf2 mRNA表达差异无统计学意义（P〉0.05）;pcDNA-Nrf2-B、pcDNA-Nrf2-C、pcD-NA-Nrf2-D mRNA表达降低,差异有统计学意义（P〈0.001）,pcDNA-Nrf2-C抑制Nrf2基因mRNA表达强于pcDNA-Nrf2-D（P〈0.05）。结论成功构建了Nrf2的microRNA表达载体pcDNA-Nrf2-C,可作为进一步研究Nrf2基因功能的工具。

摘要：本实验旨在观察乳腺癌相关抗原基因1（BRCAA1）在mcf-7细胞发生发展过程中的作用，现报道如下。一、材料与方法1．材料：人乳腺癌细胞株mcf-7、质粒转染试剂盒、细胞增殖-毒性检测试剂盒、细胞凋亡试剂盒、BRCAA1-短发夹RNA（shRNA）质粒：BRCAA1-shRNA1（BRCAA1-homo-536）：5＇-GCACTGATGTGAGTGCTAAATITCAAGAGAATTTAGCACTCACA-TCAGTGCT3’；BRCAA1-shRNA2（BRCAA1-homo-718）：5’-GCATATCAGGAAGCTGTTATCTTCAAGAGAGATAACAGCTTCCT-GATATGCTT-3’；BRCAA1-shRNA3（BRCAA1-homo-893）：5’-GCACTCCACTCATGGAAAGATTCAAGAGATCTTTCCTATGACT-GGAGTGCTT-3’；BRCAA1-shRNA4（BRCAA1-homo-1371）：5’-GGAGGATAATAGCAGTGAAGATTCAAGAGATCTTCACTGCTATT-ATCCTCCTT-3’。2．方法：mcf-7细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基。将设计好的4组质粒转染细胞，并设立空白对照组（未转染组）和阴性对照组（shRNA-NC）。细胞计数法（CCK-8）检测干扰质粒对乳腺癌细胞增殖的影响，选择增殖抑制率最佳的质粒组进行流式细胞学检测。