摘要：人工转录因子是通过模拟天然转录因子的结构,由人为设计的DNA结合结构域和功能结构域组成。人工转录因子的构建包括DNA结合结构域和功能结构域的构建,通过体外设计筛选或模建,然后进入体内与特异DNA序列结合调控目的基因的表达;目前有关人工转录因子的应用研究主要集中在人类疾病的治疗,药物发现和生产,农业生物技术及基因功能的研究等方面。

摘要：目的设计与构建特异性结合乙型肝炎病毒增强子1(HBV Enh1)的锌指蛋白人工转录因子(ZFP-ATF),检测在Hep G2.2.15细胞内的表达、对细胞生长影响及观察其抑制HBV DNA复制与表达的作用。方法构建含结合结构域ZFP与抑制性效应结构域Krüppel相关盒(KRAB)的人工转录因子(ATF),进行相关修饰、优化后,将人工合成ATF核酸序列插入真核表达质粒载体pc DNA3.1(^+),测序鉴定其正确性,X-treme GENE HP转染Hep G2.2.15细胞,共聚焦显微镜下观察ATF蛋白表达情况,CCK-8法检测ATF对细胞生长的影响,ATF转染24、48、72 h后,采用实时定量PCR、ELISA、Western blot法检测对HBV DNA复制与表达的抑制作用。结果成功构建pc DNA3.1-ATF(nls-ZFP-KRAB-FLAG)真核表达载体,ATF在Hep G2.2.15细胞中能正常表达,且对细胞生长无明显的影响,ATF具有抑制HBV DNA复制与表达的作用,在转染72 h后抑制作用达最高,抑制率达68.0%。结论构建的ATF在Hep G2.2.15细胞中能够正常表达且无毒性作用,可特异性结合HBV Enh1靶序列并具有抑制HBV DNA复制与表达的作用。

摘要：目的：设计一种可特异识别人血红素加氧酶-1基因（Hmox1）增强子的人T转录因子。方法：以锌指蛋白（ZFP）作为人工转录因子的DNA结合结构域，在人Hmox1增强子上选择一段序列作为锌指蛋白靶序列，提交Zinc finger tools3.0设计得到该锌指蛋白的氨基酸序列，通过Swiss Model同源建模，对设计结果进行分析；将锌指蛋白与效应结构域相连组成完整的人工转录因子，用双荧光素酶报告基因检测系统检测其活性。结果：得到了能特异识别人Hmox1增强子的锌指蛋白氨基酸序列，同源建模结果显示其空间结构稳定，所构建的完整人工转录因子经双荧光素酶报告基因检测系统检测能特异上调报告基因的表达。结论：设计得到的人工转录因子经实验验证能特异识别人Hmox1增强子并有效上调报告基因的表达，为进一步构建可上调细胞核内Hmox1表达的人工转录因子奠定了基础。

摘要：目的构建可靶向性识别HBV增强子的锌指蛋白人工转录因子真核表达载体,检测其在真核细胞内的表达、对细胞增殖影响及生物学活性分析。方法应用锌指蛋白(zinc finger protein,ZFP)设计工具Zinc finger tools 3.0获取人工转录因子(artificial transcription factor,ATF)结合结构域并融合抑制性效应结构域KRAB,全基因合成ATF克隆进真核表达载pcDNA3.1(+),酶切、测序来鉴定构建载体的正确性,X-tremeGENE HP转染pcDNA3.1-ATF于HepG2细胞,采用RT-PCR、免疫荧光及Western blot检测ATF mRNA与蛋白的表达情况;CCK-8检测不同浓度的ATF表达载体转染后对细胞增殖的影响;双荧光素酶报告基因检测ATF对HBV增强子序列的靶向性抑制作用。结果成功构建pcDNA3.1-ATF真核表达载体;在HepG2细胞中能够正常表达;CCK-8检测ATF对细胞增殖生长无明显的毒性作用;双荧光素酶报告基因分析ATF能靶向性结合增强子并抑制报告基因的表达。结论通过基因工程的方法构建pcDNA3.1-ATF的真核表达载体可正常表达且无明显细胞毒性作用,可靶向性识别HBV增强子并具有相应的生物学活性。

摘要：目的构建特异性结合乙型肝炎病毒X基因启动子(Hepatitis B virus X promoter,HBV Xp)的人工转录因子真核表达载体,并与拉米夫定(3TC)体外抗乙肝病毒效果进行比较研究。方法利用Zine finger tools 3.0软件设计特异性结合HBV Xp的锌指蛋白(zinc finger protein,ZFP)并融合抑制性效应结构域kRAB,全基因合成后载入真核表达载体pc DNA3.1(+),构建重组质粒pc DNA3.1(+)-nls-ZFP-kRAB-Flag(ATF)、pc DNA3.1(+)-nls-ZFP-Flag(ZFP1)、pc DNA3.1(+)-nls-kRAB-Flag(ZFP2),通过酶切、测序鉴定重组质粒的正确性,Western blot和细胞免疫荧光鉴定重组质粒在Hep G2细胞表达情况。将重组质粒转染Hep G2.2.15细胞,设空白组(Blank组)、ATF组、ZFP1组、ZFP2组、空质粒组(Empty vector组)和拉米夫定组(3TC组),分别培养2、6、10 d,用Western blot、FQ-PCR、ELISA分别检测各组HBx蛋白、HBV DNA、上清中HBs Ag和HBe Ag的表达情况。结果重组质粒成功构建且能在Hep G2细胞中表达;ATF组抑制Hep G2.2.15细胞中X蛋白和HBV DNA的表达,与其余各组相比差异有统计学意义(P<0.05),且6 d和10 d抑制作用强于2 d;3TC组亦能抑制Hep G2.2.15细胞中X蛋白和HBV DNA的表达(P<0.05)。ATF组能抑制上清中HBs Ag,HBe Ag的分泌,与其余各组相比差异有统计学意义(P<0.05);3TC组亦能抑制上清中HBs Ag,HBe Ag的分泌(P<0.05)。结论人工设计的特异性ATF在真核细胞中能正常表达,并能有效发挥抑制HBV的作用,且抑制作用强于拉米夫定。

摘要：目的观察A20基因的人工锌指转录因子(zinc finger-artificial transcription factor,ZF-ATF)对内源性A20基因及内皮细胞炎症反应的影响。方法根据人A20基因的序列,设计出其ZF-ATF,合成靶序列Oligo DNA,退火形成双链DNA,与通过BamHⅠ和KpnⅠ酶切后的载体连接产生ZF-ATF真核载体,质粒转化感受态细菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,限制性内切酶酶切鉴定,鉴定阳性克隆进行测序。质粒DNA转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cell,HUVEC),通过Western blot检测A20蛋白的表达,用脂多糖(LPS)诱导HUVEC细胞产生炎症反应,利用Western blot检测NF-κB p65的表达情况,利用ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-8等的水平。结果限制性内切酶酶切鉴定与DNA测序证实合成的含ATF的真核载体寡核苷酸链插入正确,Western blot证实转染HUVEC后A20蛋白表达显著增加。ELISA法检测结果表明,在LPS刺激后,空载体组及空白组细胞因子IL-8、IL-6、TNF-α表达均明显上调,而ZF-ATF转染组没有明显上调,与空载体组及空白组比较,有统计学差异(P<0.05,P<0.01);Western blot证实在LPS刺激后ZF-ATF转染组NF-κB p65的表达(19.8±4.5)较空载体组(90.2±5.9)及空白组(96.3±3.3)显著下调(P<0.01)。结论成功构建人工锌指转录因子真核表达载体,且能够启动内源性A20的稳定表达,并发挥其抗炎等作用。