摘要：目的:构建携带人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)慢病毒表达载体LV3-shRNA-hTERT及其病毒包装鉴定并稳定转染宫颈癌Caski细胞系。方法:使用Designer3.0(Genepharma)软件设计靶向hTERT的小发卡RNA(shRNA)序列,将hTERT-shRNA基因片段插入慢病毒载体pGLV3/H1/GFP+Puro中,构建慢病毒表达质粒LV3-shRNA-hTERT。通过酶切、DNA测序验证hTERT片段的准确性,将LV3-shRNA-hTERT与包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清并测定病毒滴度获得重组慢病毒,将该重组慢病毒感染Caski细胞,通过观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达判断转染成功与否以及估计转染效率,RTPCR、Western blot分别测定转染后不同时间点的hTERTmRNA水平和hTERT蛋白表达情况,TRAP-ELISA法测定细胞端粒酶活性。结果:LV3-shRNA-hTERT携带正确hTERT基因,重组病毒经PCR证实hTERT-shRNA基因插入。利用重组慢病毒介导将重组质粒LV3-shRNA-hTERT高效转导入宫颈癌Caski细胞并稳定表达,荧光显微镜观察转染后24 h Caski细胞即开始发出绿色荧光,72 h后有大量荧光表达,而在稳定转染空质粒的Caski细胞中不表达。检测转染后的Caski细胞,发现有3条链能明显抑制hTERT mRNA和蛋白水平的表达,并显著降低了细胞端粒酶活性,其中以72H-TERT-1515抑制作用最强,对hTERTmRNA和蛋白的抑制率分别达75.0%和70.3%,端粒酶活性下降74.6%。结论:成功构建携带hTERT-shRNA慢病毒表达载体LV3-shRNA-hTERT,并稳定转染Caski细胞系,实验设计的shRNA能有效抑制宫颈癌Caski细胞hTERT mRNA水平和hTERT蛋白表达,并显著降低细胞端粒酶活性。为端粒酶在宫颈癌发病机制的研究、宫颈癌基因治疗的体外干扰治疗奠定了工作基础。

摘要：目的构建及鉴定携带沉默人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase,h TERT)慢病毒(lentivirus,LV)表达载体,并观察其在子宫颈癌caski细胞的表达情况。方法以Designer3.0(Genepharma)软件设计靶向h TERT基因特异性的小片段RNA(sh RNA)干扰序列,将h TERT-sh RNA基因片段插入重组慢病毒p GLV3/H1/GFP+Puro,构建慢病毒表达质粒LV3-sh RNA-h TERT,酶切、DNA测序验证h TERT片段准确性。LV3-sh RNA-h TERT与包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清液并测定病毒滴度获得重组慢病毒后感染caski细胞。将细胞分为空白对照组(未感染病毒的caski细胞)、阴性对照组(感染空载病毒LV3-sh NC的caski细胞)和h TERT干扰组(感染携带LV3-shh TERT慢病毒的caski细胞)。绿色荧光蛋白(GFP)的表达判断转染结果并估计转染效率,流式细胞术仪检测病毒感染率,实时荧光定量PCR法(q RT-PCR)检测转染后基因h TERT m RNA的表达情况,CCK-8法检测caski细胞增殖情况。结果将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒,且能有效感染子宫颈癌caski细胞。荧光定量PCR检测结果证实构建的h TERT-小片段干扰RNA慢病毒表达载体可显著抑制h TERT基因的表达。h TERT干扰组细胞增殖受抑制,生长速度较阴性对照组生长缓慢。结论成功构建了携带h TERT-sh RNA慢病毒表达载体LV3-sh RNA-h TERT,并稳定转染子宫颈癌caski细胞。该载体能够有效抑制h TERT的表达,使子宫颈癌caski细胞增殖缓慢,为进一步探讨h TERT基因在子宫颈癌的发病机制和体外基因干预治疗奠定基础。

摘要：目的通过构建靶向人端粒酶催化亚基人端粒酶逆转录酶基因（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）RNA干涉（RNA interference，RNAi）慢病毒载体，获得可供转染的滴度，为进一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础。方法根据hTERT设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链插入到pLVTHM质粒，生成含RNAi盒的载体，然后与pCMV—dR8．74和pMD2G病毒包装所必须的元件经脂质体导入T293细胞，包装成慢病毒，收集上清浓缩病毒并检测其滴度。所得病毒感染U87胶质瘤细胞，逆转录PCR和端粒重复序列扩增法（telomeric repeat amplification protocol, TRAP）检测干扰后细胞内hTERT表达变化及端粒酶表达变化，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果将目的序列成功连接到载体上，并经测序分析证实载体构建成功；成功包装成高滴度的慢病毒。逆转录PER和TRAP检测结果证实构建的hTERT-小片段干涉RNARNA （small interference RNA,siRNA）慢病毒表达载体可显著抑制hTERT基因的表达和端粒酶活性并导致细胞凋亡。结论成功构建了携带靶向hTERT基因的RNAi慢病毒载体。该载体能够有效抑制hTERT的表达和端粒酶活性并导致细胞凋亡，为以hTERT为靶点的胶质瘤基因治疗的后续研究奠定基础。

摘要：目的:探讨RNA干扰技术使人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因沉默,对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的抑制作用。方法:针对hTERT基因设计构建多种siRNA表达载体,并转染至膀胱肿瘤BIU-87细胞,通过实时荧光定量、单四唑(MTT)检测端粒酶活性,观察siRNA表达载体对hTERT基因表达的影响。结果:实时荧光定量和MTT检测证明,所构建的载体能导致不同程度的hTERT基因沉默,并成功地抑制BIU-87细胞的生长。结论:RNA干扰膀胱尿路上皮癌细胞(BIU-87)端粒酶hTERT基因,能影响端粒酶基因的表达,为进一步研究端粒酶活性在膀胱尿路上皮癌中的作用奠定了基础。

摘要：人端粒酶逆转录酶（hTERT）是端粒酶活性的主要调控因子，对细胞的恶性转化、肿瘤的发生发展意义重大，目前已成为肿瘤基因治疗的理想靶标。我们应用RNA干扰技术设计和构建有效靶向hTERT基因的真核表达质粒，并加以鉴定。