摘要：为了建立梨形虫(Piroplasmida)和伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)的双重PCR检测方法,试验根据梨形虫的18S rRNA基因和伊氏锥虫的kDNA基因设计两对特异性引物,以吕氏泰勒虫和伊氏锥虫阳性样品DNA为模板进行单重PCR和双重PCR,并对双重PCR的退火温度进行优化,对本研究建立并优化的双重PCR方法进行特异性试验、敏感性试验及临床样品的检测。结果表明:本研究建立的双重PCR方法能够扩增出350 bp和600 bp的特异性目的条带,而无浆体、肝簇虫、弓形虫和埃立克体样品均呈阴性,梨形虫和伊氏锥虫最低检测浓度分别为54.70 fg/μL和14.30 fg/μL,用本试验建立的方法对临床样品的检测结果与对照方法(巢式PCR)检测结果一致。说明本研究成功建立了灵敏、快速、简便、特异性高的双重PCR检测方法,能够用于梨形虫和伊氏锥虫的临床检测及流行病学调查。

摘要：为了探索伊氏锥虫抗原的变异规律及其用于免疫预防的可能性 ,首先对伊氏锥虫安徽株单虫克隆 2个早期变异体 Sh Tat1.1、Sh Tat1.2采用蛋白酶抑制剂 TL CK处理 ,分离纯化这 2种变异体的 VSG,用 Sh Tat1.1VSG免疫 KM小鼠 ,Sh Tat1.1锥虫攻击免疫鼠后 6 d分离锥虫 ,经间接免疫荧光试验 (IFT)和班点酶标记试验 (Dot- EIA)鉴定为Sh Tat1.2 ,说明同一克隆锥虫感染兔、小鼠第 1次发生抗原变异后产生的变异体相同。依据这一规律 ,设计了免疫预防保护试验 ,试验小鼠分 3组 :一组为未免疫对照组 ,一组为 Sh Tat1.1VSG单一抗原免疫组 ,另一组为 Sh Tat1.1VSG、Sh Tat1.2 VSG混合免疫抗原免疫组 ,各组均以 Sh Tat1.1锥虫攻击 ,结果 Sh Tat1.1VSG+Sh Tat1.2 VSG免疫组小鼠全部获得保护 ,单用 Sh Tat1.1VSG免疫组小鼠和未免疫小鼠血中全部出虫、死亡 ,前者比后者出虫时间、存活时间延长。提示运用伊氏锥虫抗原变异这一规律设计的这种复合抗原 ,能激发宿主克服虫体抗原变异对免疫保护的干扰。

摘要：根据引物设计的一般原则,参照伊氏锥虫HGPRT基因的核苷酸序列设计、合成一对引物,PCR扩增伊氏锥虫HGPRT基因cDNA。低熔点琼脂糖回收PCR产物,并将其克隆至pGEM-TEasy载体中,经酶切、PCR鉴定和序列分析,获得重组中间质粒pGEM/HGPRT。重组中间质粒pGEM/HGPRT经NcoⅠ和SalⅠ双酶切,回收目的片段HGPRT,以非融合形式插入原核表达质粒pBV220构建表达质粒pBV/HGPRT,转化大肠杆菌DH5α,42℃诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描分析,表达产物HGPRT的分子量约为23kD,与理论推算值相符,表达率占总菌体蛋白的19%,经间接ELISA检测,表达产物能被伊氏锥虫阳性血清所识别。

摘要：对伊氏锥虫(Trypanosomaevansi):新疆株(XJCA)、湖北株(HBM)、云南株(YNB)、广东株(GDB2);马媾疫锥虫(Trypanosomaequiperdum)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、刚果锥虫(Trypanosomacongolense)提取基因组DNA,根据已报道的伊氏锥虫株18SrDNA基因序列设计合成引物,用PCR扩增了锥虫虫株基因组DNA,伊氏锥虫新疆株、湖北株、云南株、广东株、布氏锥虫、刚果锥虫均为373bp的片段;马媾疫锥虫为372bp的片段,PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化,纯化后PCR产物经连接、转化后测序,将测得的序列用DNAMAN软件分析并与国外已发表的相应序列进行了同源性比较,并绘制了系统发育进化树。结果与国外AJ009153、AJ223564、D89527株同源性达到99%～100%,与另外11株同源性75%。本研究为锥虫分子流行病学研究及分类研究打下基础。

摘要：为探讨伊氏锥虫对安锥赛抗药性的分子机理,以布氏锥虫对砷剂药物抗药性相关的TbTA1基因设计引物,以55℃、57℃、60℃、63℃和65℃不同退火温度,分别从伊氏锥虫敏感株的cDNA和基因组DNA中扩增出TbTA1基因的全长序列,但是从安锥赛抗药株伊氏锥虫的cDNA和基因组DNA中都未扩增出TbTA1基因,这表明基因TbTA1可能与伊氏锥虫安锥赛抗药性的产生有关。伊氏锥虫与布氏锥虫的TbTA1基因序列比较,它们有10个碱基不同,即第88位的G(T.e)-A(T.b)、第144位的T(T.e)-C(T.b)、第224位的C(T.e)-T(T.b)、第471位的C(T.e)-T(T.b)、第472位的A(T.e)-G(T.b)、第549位的G(T.e)-T(T.b)、第1 008位的C(T.e)-T(T.b)、第1 033位的A(T.e)-G(T.b)、第1 293位的A(T.e)-G(T.b)和第1 384位的T(T.e)-C(T.b),其中有5个碱基所编码的氨基酸不同,即Val30(T.e)-Ile(T.b)、Ala75(T.e)-Val(T.b)、Ile158(T.e)-Val(T.b)、Thr345(T.e)-Ala(T.b)和Ser462(T.e)-Pro(T.b),这表明伊氏锥虫与布氏锥虫的TbTA1差异可能是它们的种间差异。

摘要：应用异硫氰酸胍一酚一氯仿一步法分离伊氏锥虫安徽株克隆虫体ShTatl的二个抗原变异体ShTat1 3和ShTat1 5总RNA ,在含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳后 ,转印到硝酸纤维膜上。根据布氏锥虫VSGmRNA3’端保守序列 ,设计合成了一个互补于它的含十八个碱基的寡核苷酸 5’—GGTGTTAAAATATATCAG— 3’ ,经32 P标记 ,Northern杂交 ,首次证明伊氏锥虫含有同样的保守序列。利用合成的十八碱基寡核苷酸作为反转录特异引物 ,成功合成cDNA第一链 ,以cDNA第一链作为PCR扩增模板 ,均能特异性的扩增出一条主带为 1 5kb的DNA ,与VSG基因大小相符。根据所有锥虫mRNA在 5’端的保守序列 ,设计合成了RT -PCR下游引物 5’—GAACAGTTTCTG TACTATATTG— 3’。对伊氏锥虫安徽株克隆虫体的二个变体ShTat1 3和ShTat1 5的RNA ,进行RT—PCR扩增 ,均特异性地分离出VSG基因 ,二个变异体VSG基因大小差异显著 ,其中ShTat1 3的VSG基因为 1 7kb ,而ShTat1 5的VSG基因则为 1 4kb。

摘要：应用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分离伊氏锥虫安徽株克隆虫体 ShTatl 的二个抗原变异体ShTatl.3和 ShTatl.5总 RNA,在含有甲醛的琼脂凝胶电泳后,转印到硝酯纤维膜上.根据布氏锥虫 VS-Gm RNA3′端保守序列,设计合成了一个互补于它的含18个碱基的寡恢苷酸5′-GGTGTTAAAATA-TATCAG-3′.经^(32)P 标记、Northern 杂交,首次证明伊氏锥虫含有同样的保守序列.利用合成的18碱基寡核苷酸作为反转录特异引物,成功合成 cDNA 第一链,以 cDNA 第一链作为 PCR 扩增模板,均能特异性的扩增出一条主带为1.5kb 的 DNA,与 VSG 基因大小相符.根据所有锥虫 mRNA 在5′端的保守序列,设计合成了 RT-PCR 下游引物5′-GAACAGTTTCTGTACTATATTG-3′.对伊氏锥虫安徽株克降虫体的二个变体 ShTatl.3和 ShTatl.5的 RNA,进行 RT-PCR 扩增,均特异性地分离出 VSG 基因,二个变异体 VSG基因大小差异显著,其中 ShTatl.3的 VSG 基因为1.7kb,而ShTatl.5的 VSG 基因则为1.4kb.

摘要：为建立奶牛附红细胞体和伊氏锥虫两种病原诊断方法并探索二者之间在奶牛感染中的关系,本研究针对两病原分别设计两对特异性引物,建立了奶牛附红细胞体和伊氏锥虫感染的二重PCR诊断方法,其扩增片段大小分别为415bp和237bp。敏感性试验和特异性试验表明,附红细胞体和伊氏锥虫的DNA的最低检测量为0.154pg和0.105pg;与猪肺炎支原体、大肠杆菌、葡萄球菌、鸡艾美耳球虫、牛双芽巴贝斯虫无交叉反应。35份临床血样检测结果为:奶牛附红细胞体阳性率22.89%,伊氏锥虫阳性率8.89%,其中共感染率为2.89%。临床试验表明,该方法可用于奶牛附红细胞体和伊氏锥虫的诊断,特别适用于早期诊断。

摘要：伊氏锥虫是动物伊氏锥虫病的病原体，属动基体目原虫。动基体ＤＮＡ（Ｋｉｎ－ｅｔｏｐｌａｓｔＤＮＡ，简称ｋＤＮＡ）是该目原虫所特有的一种非染色体ＤＮＡ。因此，对ｋＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，即聚合酶链反应）可用于鉴定和检测伊氏锥虫。本文以５’－ＣＡＡＣＧＡＣＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＴ－３’，５’－ＡＣＧＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＡＴＧＧＴ－３’为引物，对从伊氏锥虫直接抽提的总ＤＮＡ，ｋＤＮＡ以及ｋＤＮＡ基因重组子，经ＰＣＲ扩增后，在含有０．５μｇ／ｍｌＥＢ的２％琼脂糖凝胶上电泳，紫外光检测，均显示有一条桔红色的荧光带，与ＤＮＡ分子量标准对照分析，扩增的ＤＮＡ片段分子量在６００ｂｐ以下，与实验设计的扩增片段长度相符，而总ＤＮＡ不加聚合酶反应体系和总ＤＮＡ对照均无此片段。表明实验所设计引物对伊氏锥虫微环ＤＮＡ具有特异性。本方法的建立为进一步研究我国伊氏锥虫ＤＮＡ工作打下了基础。

摘要：参照布氏锥虫 HGPRT基因的核苷酸序列 ,设计一对引物 ,分别以伊氏锥虫 HGPRT缺陷株和自然株的总 RNA为模板进行 RT—PCR扩增 ,结果自然株出现 630 bp的 DNA条带 ,与设计大小一致 ,而缺陷株均为阴性 ,证明缺陷株的 HGPRT基因发生明显突变或缺失。自然株 HG-PRT基因经与 p GEM- T Easy Vector连接 ,大肠杆菌转化 。