摘要：根据已有的伯氏疏螺旋体鞭毛基因序列,设计两条特异性引物,PCR扩增该基因,并获得基因全长序列,大小为1 008 bp。采用生物信息学技术,对所获得的伯氏疏螺旋体鞭毛基因序列和拟编码的蛋白序列进行分析,发现其编码336个氨基酸,编码蛋白的理论分子量为35.7 ku,等电点为5.53,具有多个抗原表位序列,其中编码主要抗原位点的片段位于中央区段,该中央区段还具有伯氏疏螺旋体种的保守性。伯氏疏螺旋体鞭毛基因中央区段编码蛋白既是主要的抗原位点又具有保守性,理论上可作为莱姆病的诊断抗原。本文为莱姆病的实验室诊断奠定基础。

摘要：自我国黑龙江省尚志市野外采集的蜱体内分离出1株莱姆病伯氏疏螺旋体,并对其进行了形态观察及分子生物学分析。利用BSK H分离培养法,经暗视野显微镜和姬姆萨染色观察,菌体呈螺旋状。根据已报道的伯氏疏螺旋体16S rRNA基因序列设计引物,结合参考文献设计的外膜蛋白A(OspA)基因引物经PCR扩增并测序,与GenBank中的各种伯氏疏螺旋体基因型建立系统发生树并进行同源性分析。结果表明,16S rRNA基因核苷酸序列与GenBank中的伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)DK27(X85193)具有较高的同源性,可达99.5%;OspA基因核苷酸序列与报道的Borrelia gariniiKhab(AY502600)有较高的同源性,为93.6%。根据序列分析结果,认为该分离株属于Borrelia garinii基因型,命名为SZ,该菌株16SrRNA基因和OspA基因核酸序列已提交到GenBank(登录号分别为HM007279和HM007278)。

摘要：使用环介导恒温扩增技术,基于莱姆病病原伯氏疏螺旋体的外膜蛋白A(OspA)基因,针对伯氏疏螺旋体不同的基因型设计特异性引物,对国内主要的莱姆病病原伯氏疏螺旋体的3个基因型进行分型鉴定。研究结果表明,设计的引物具有良好的特异性,可以对狭义伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu strict)、嘎氏疏螺旋体(***)和伽氏疏螺旋体(***)进行分型鉴定。伯氏疏螺旋体的分型鉴定可以对不同临床症状莱姆病患者的治疗和莱姆病的控制提供一定的依据。

摘要：本试验采用重组酶介导等温核酸扩增(RAA)技术建立伯氏疏螺旋体核酸的检测方法。根据伯氏疏螺旋体16S rRNA基因保守序列设计并合成特异性RAA引物,采用重组酶介导扩增技术电泳法,以10倍系列稀释1 ng/μL伯氏疏螺旋体B31基因组DNA为模板进行RAA,测定该方法的敏感性。通过对大肠杆菌、沙门菌、钩端螺旋体基因组DNA扩增验证该方法的特异性。结果显示,该方法对伯氏疏螺旋体标准株的B31基因组DNA检测限约为100 fg/μL,对大肠杆菌、沙门菌、钩端螺旋体均无扩增,具有良好的特异性。RAA具有特异性高、检测快速、灵敏等优点,本研究建立的伯氏疏螺旋体RAA检测方法,为伯氏疏螺旋体临床样本的快速诊断提供依据。

摘要：为建立一种TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR方法,来快速、特异地检测伯氏疏螺旋体,根据GenBank发表的伯氏疏螺旋体16SrRNA序列,应用分子生物学软件进行比对,选取保守序列设计特异性引物及TaqMan-MGB探针,并优化荧光定量PCR反应体系及条件,分别对大肠杆菌、沙门氏菌及钩端螺旋体进行扩增;构建伯氏疏螺旋体标准株16SrRNA基因片段阳性质粒,10倍系列稀释后进行real-timePCR扩增,测定该方法的敏感性。结果可见:仅伯氏疏螺旋体出现阳性扩增,而大肠杆菌、沙门氏菌及钩端螺旋体扩增均为阴性;该方法对阳性质粒的检测限约为100copies/μL。应用该方法对新疆地区的100份蜱DNA样本进行检测,发现7份为伯氏疏螺旋体阳性。结果表明,本研究建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法具有较高的特异性及良好的敏感性,为今后伯氏疏螺旋体的快速诊断及流行病学调查提供了技术支撑。

摘要：目的建立一种检测伯氏疏螺旋体的分型多重实时荧光定量PCR方法,可对3种致病基因型伽氏疏螺旋体***、阿氏疏螺旋体***、狭义伯氏疏螺旋体*** sensu stricto检出并分型。方法针对3种基因型菌株的外膜蛋白osp C基因,在保守序列设计通用引物并分别设计型特异Taqman探针,3条探针分别标记FAM、Texas Red和CY5荧光报告基团,建立和优化多重实时荧光定量PCR反应体系,检测其敏感性和特异性。结果建立的多重荧光定量PCR的最低检测值为*** 40copies/μl、*** 5.17copies/μl和*** sensu stricto 37.8copies/μl,通过检测立克次体、土拉弗朗西斯菌无交叉反应,检测100只游离蜱与常规PCR结合测序结果分型一致,说明本方法有较好的灵敏性和特异性。结论该方法能快速检测伯氏疏螺旋体并同时分型,为莱姆病的诊断提供新方法。

摘要：为建立一个荧光定量PCR检测硬蜱体内莱姆病螺旋体的方法,根据GenBank登录的莱姆病螺旋体鞭毛蛋白FlaB序列,应用生物学软件进行序列比对,在保守的C段区设计与筛选特异引物和TaqMan探针。对荧光定量PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性,并通过对感染螺旋体的蜱样本的检测,评价该方法的实用价值。结果显示,自然感染莱姆病螺旋体的35份蜱标本检测阳性符合率100%,正常蜱20份标本的检测结果均为阴性。该方法对牛巴贝斯原虫、泰勒原虫、边缘无浆体、金龟子绿僵菌、大肠杆菌等蜱体常见病原微生物所抽提的DNA的检测均呈阴性。荧光定量PCR方法检测质粒的灵敏度可达1×102拷贝/μL。TaqMan荧光定量PCR方法检测硬蜱体内莱姆病螺旋体具有较好的敏感性和特异性,可适于莱姆病的流行病学调查和监控。

摘要：目的以伯氏疏螺旋体标准株B31株基因组DNA为模板,PCR扩增bmpA全基因序列,定向克隆和高效表达重组BmpA并纯化。方法 1)以伯氏疏螺旋体标准株B31株基因组DNA为模板,设计定向克隆引物,PCR扩增bmpA全基因序列,定向克隆入表达载体pGEX-6p-1,酶切鉴定后转化大肠埃希菌BL21菌株,获得bmpA重组菌;2)从重组菌培养温度,诱导时间,诱导剂的剂量,菌密度(A600)等方面优化诱导条件,确定高效表达重组BmpA的最佳方案;3)用GSH柱纯化重组BmpA,探索纯化BmpA的最佳条件。结果 1)在基因水平和蛋白水平上均得到目的条带和目标峰,确定表达载体bmpA-pGEX-6p-1构建成功并表达重组BmpA;2)重组质粒在37℃,IPTG诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为6h,菌液的A600值为0.5～1.0以及在LB培养基上培养GST-bmpA融合蛋白表达量达到最大;3)在最佳表达条件下1L重组菌能得到2.9～3.1mg纯化BmpA蛋白。结论成功构建了表达重组蛋白BmpA的大肠埃希菌原核表达系统,确定了高效表达重组BmpA的最佳方案,并证明用GSH柱纯化重组BmpA效果较好。

摘要：目的建立多重荧光定量PCR快速检测以鼠为宿主伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫的方法,对预防3种病原体引发的疫情具有重要意义。方法通过设计特异性引物和探针,扩增伯氏疏螺旋体23S rRNA基因,弓形虫的B1基因和恶性疟原虫的SSU基因,采用倍比梯度稀释法检测该体系的灵敏度,以另外8种以鼠为宿主的致病菌评价检测体系的特异性;建立了同时感染3种病原体的鼠全血模拟样本检测试验,以验证方法的适用性。结果建立自鼠血液模拟样本中同时检测伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫的多重荧光定量PCR方法,检测3种病原体的灵敏度分别为5.5、12.8、17.2拷贝/μl,特异性强。结论建立了多重荧光定量PCR检测伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫方法,缩短了检测时间,在疾病防控等方面有很好的应用前景。

摘要：目的建立一种多重实时荧光定量PCR法,同时检测常见蜱传病原体嗜吞噬细胞无形体、伯氏疏螺旋体及斑点热群立克次体(SFGR)。方法针对各病原体的保守区序列设计特异性引物及TaqMan探针,建立并优化多重实时荧光定量PCR反应体系,评价方法的特异性、灵敏度、重复性及对蜱样本的检测准确性。结果建立的多重实时荧光定量PCR法检测嗜吞噬细胞无形体、伯氏疏螺旋体、SFGR,与大肠埃希菌、问号钩端螺旋体、布鲁氏菌等病原体间无交叉反应,特异性良好;灵敏度均达到102拷贝/μl,重复性变异系数均<2.00%;蜱样本检测中,多重实时荧光定量PCR法与单重实时荧光定量PCR法检测结果一致性为100%。结论研究建立的3种蜱传细菌性病原体多重实时荧光定量PCR法特异性好、灵敏度高,为蜱传病原体的检测提供了技术手段。