摘要：【目的】研究BaMV福州分离物BaMV-TMS1及其携带的卫星RNA(satBaMV)分离物satBaMV-TMS1的全基因组特征,明确其系统发育关系;对BaMV进行c DNA侵染性克隆构建方法的改进,为其反向遗传学体系的快速建立提供简便的方法。【方法】根据已报道的BaMV和satBaMV全长序列保守区分别设计2对和1对扩增引物,从感染BaMV的竹叶中扩增、克隆获得BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1的全长序列,并进行序列特征分析和系统发育树构建。采用多片段无缝克隆方法将扩增得到的2个病毒DNA片段和载体进行连接并转化农杆菌,接种本氏烟后检验其侵染性。【结果】测序获得的BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1分离物核苷酸序列全长分别为6 366和834 nt(不含3'端的多聚腺苷酸尾),具有典型的BaMV和satBaMV基因组结构特征。BaMV-TMS1分离物与已报道的其他分离物序列同源性为82%~83%,而satBaMV-TMS1分离物与其他分离物的序列同源性为92%~93%。系统进化树分析表明,BaMV-TMS1分离物可单独形成一簇,satBaMV-TMS1分离物也单独形成一个新的分支。侵染性克隆通过农杆菌注射接种本氏烟10天以后,RT-PCR检测以及透射电镜负染观察结果都验证病毒成功侵染。【结论】BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1分离物与已知序列有着较高的变异度且生成新的系统发育树分支,体现了该病毒与卫星RNA较高的遗传多样性。本研究成功构建具有生物活性的BaMV侵染性克隆且构建方法相对简单快速。

摘要：本文介绍了一种构建辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)侵染性克隆的简易方法.基于辣椒脉斑驳病毒的全长确定序列,根据基因内部的单一限制性酶切位点,设计引物,将ChiVMV分成KL1,KL2,KL3三个片段通过RT-PCR和TA克隆的方法将3个片段构建到PMD19-T载体上.通过双酶切将ChiVMV前面7000bp的片段构建到载体上,从而将全部的ChiVMV cDNA分段构建到两个重组质粒中,成功地避免了全长病毒序列在大肠杆菌中不稳定的现象.进行体外转录时,先通过PCR扩增出两个彼此有一定重叠的平末端片段,再利用两个重叠片段为模板用重叠PCR的方法扩增出全长带T7启动子的ChiVMV cDNA,并通过T7RNA聚合酶成功转录出ChiVMV的病毒RNA.

摘要：马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viriod,PSTVd)侵染马铃薯会严重影响薯块的产量和品质。根据PSTVd的同源序列设计引物,以山西省马铃薯感病块茎中提取的总RNA为模板,经RT-PCR方法扩增出全长cDNA片段,将其克隆到质粒pBS-T载体上,进行序列分析。结果表明,该类病毒全长359 nt,能通过分子内序列互补形成致密的二级结构。以该序列作为种子序列进行Blast搜索,该序列与PSTVd荷兰分离物(GenBank登陆号:AY372400.1)的序列一致性为100%。将该序列与东北株系、河北株系及已公布的弱株系(GenBank登陆号:M14814.1)、强株系(GenBank登陆号:U23058.1)、中间株系(GenBank登陆号:AY937179.1)比对,有12个核苷酸具有多态性,其中有5个发生在致病区。将线性化的质粒pBS-PSTVd及其PSTVd的体外转录产物接种番茄矮红宝的无毒苗,20 d后接种株轻微显症,RT-PCR检测均呈阳性。将RT-PCR产物测序,其结果与接种的PSTVd原序列完全一致,证实构建的PSTVd山西分离物的克隆具有侵染性。

摘要：越南黄麻黄脉病毒(Corchorus yellow vein Vietnam virus,CoYVV)是影响黄麻纤维品质和产量的双生病毒,其基因组含2个环状单链DNA(DNA-A和DNA-B)。鉴定黄麻双生病毒CoYVV并筛选抗病毒种质,不仅丰富对双生病毒分布和进化的认识,而且为黄麻抗性基因克隆奠定了基础。2018年福建省三明市福建农林大学洋中科教基地发现黄麻种质资源圃长果种黄麻福农5号疑似感染黄色花叶病。利用CTAB法提取该品种感病叶片DNA,通过PCR、滚环扩增及测序技术获得病毒基因组序列。通过同源序列比对和进化树构建明确该病毒与新旧世界双生病毒的关系。含有CoYVV DNA-A和CoYVV DNA-B侵染性克隆载体的农杆菌等比例混合,子叶注射法侵染具有代表性的7份长果种和7份圆果种黄麻品种(系),定期观察发病株数(病株率)并PCR检测接种黄麻的侵染率。PCR检测结果证实,福农5号病样感染了CoYVV,命名为CoYVV-FS。其DNA-A为2724 bp,DNA-B为2691 bp。进化分析表明,相较于旧世界菜豆金黄花叶病毒(begomoviruses),CoYVV-FS与新世界begomoviruses更近。农杆菌接种14份黄麻品种43 d时,统计病株率和侵染率。结果表明该病毒可以成功侵染13份黄麻品种,病株率和侵染率分别在0~60%和0~100%之间,说明该病毒在黄麻中具有较高侵染性。807元引马里的病株率和侵染率皆为0,表现为抗性种质;而巴长4号和印度墨绿子在接种30 d时产生黄脉、卷曲等典型的表型,表现出对CoYVV具有高度感病性。黄麻种植资源圃发现的CoYVV-FS与前期已报道的CoYVV属于同一分离物,它能侵染多数黄麻种质,在长果种黄麻上引起严重症状。

摘要：为了开发番茄对番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)抗病性鉴定的新技术,设计了在番茄试管苗中接种TYLCV的试验。将对TYLCV感病的品种‘Moneymaker’、‘中蔬6号’、‘丽春’和抗病品系‘AVRDC CLN2123 A’在试管中进行组织培养,21～25d后切取长2.0～2.5cm的嫩枝,将嫩枝基部在含TYLCV-[CN:SH2]侵染性克隆质粒的农杆菌EHA105菌株的悬浮液(OD 600 0.5)中浸润1min接种。14d后,感病品种试管苗开始出现TYLCV症状并且愈来愈重,28d后TYLCV症状十分典型,56d后症状极其严重:叶片窄小、黄化、极度卷曲,植株严重矮化,停止生长或死亡;而同样接种的抗病品系试管苗却无一发病。接种的番茄试管苗经PCR检测显示,从感病品种试管苗中均能扩增到356bp的特异片段,而在抗病品系中无此条带。这些结果显示了在试管里鉴定番茄品种或材料对TYLCV抗性的可能性。